自体红骨髓及其不同成分复合PCPC修复兔桡骨缺损的实验研究

方 勇 肖玉周 廖中亚

（安徽省亳州市人民医院骨科，安徽 亳州 236800）

自体红骨髓及其不同成分复合PCPC修复兔桡骨缺损的实验研究

方 勇 肖玉周 廖中亚

（安徽省亳州市人民医院骨科，安徽 亳州 236800）

目的研究自体红骨髓复合多孔磷酸钙骨水泥对骨缺损的治疗效果，希望通过实验验证自体红骨髓中促进骨缺损愈合的相关成分。方法选择体质量范围在2.5～3.0 kg的新西兰大白兔60只。实验中建造新西兰大白兔双侧桡骨骨缺损模型（骨缺损大小1.5 cm）。利用随机分组法将120侧桡骨骨缺损模型分为五组，分别为A、B、C、D、E组，每组24侧桡骨骨缺损模型，以E组作为实验对照组。A组：自体红骨髓+PCPC；B组：骨髓单个核细胞+PCPC；C组：无细胞成分骨髓液+PCPC；D组：去上清液骨髓细胞成分+PCPC；E组：单纯PCPC。标本采集及数据分析：获取标本时间分别为手术后第4、8、12周），每个获取标本时间点每个实验组选取6只新西兰大白兔，其中3只行X线摄片，另外3只兔子处死后用于组织形态学研究，研究不同时间段中骨缺损模型中新生骨生产情况。结果利用改良Lane-Sandhu X线评分标准对标本X线结果进行评分并完成统计学分析。结果不同时间段实验标本的大体解剖学观察、X线摄片和组织学观察显示，在植入物内部骨细胞、骨小梁、骨基质、骨质重塑上，以及PCPC降解情况，ARBM接种PCPC复合人工骨组（A组）明显优于其他各组。Lane-Sandhu X线及组织学评分差异有统计学意义（P＜0.05）。结论新西兰大白兔自体红骨髓中的有形成分（如细胞成分）以及骨髓上清液中的无形成分（如生长因子）对骨缺损的修复均有促进作用。另外红骨髓中的有形成分（细胞成分）以及无形成分（含生长因子的骨髓上清液）在促进骨缺损的修复中存在协同作用。自体红骨髓中的有形成分（骨髓单个核细胞）在促进骨缺损愈合过程中起到主要作用，可以将红骨髓的促新骨形成作用应用于骨缺损的治疗中。

磷酸钙骨水泥；CPC；ARBM；自体红骨髓；骨髓单个核细胞；骨缺损；多孔

骨缺损是骨科研究领域的重要课题之一，骨缺损治疗起来较为棘手，若治疗不当可导致严重的后果，给患者带来很大的痛苦，机体功能以及生活质量严重降低，骨缺损的传统治疗方案很多，如自体骨或异体骨移植、应用生物替代材料以及骨延长术等，但上述方法或多或少存在不同的短板及局限性，自体骨或异体骨移植材料需要进行处理，如各种灭菌、灭活处理，导致成骨成分丧失，另外由于是非自身骨还存在不同程度的排斥反应。生物替代材料虽然无排斥反应，但无促进骨愈合功能，另外骨延长术也存在一定的缺点，如治疗时间长、并发症多，治疗费用高等。

现如今大家较为公认的治疗骨缺损“金标准”的方法是自体骨移植，但因为自体骨移植也存在一定的不足之处，如：①自体骨骨源及数量的限制；②供骨区的创伤及并发症，自体骨移植在骨缺损治疗中也存在较大的限制，所以研究者们一直致力于寻找更新的治疗方案，或从自体骨移植的不足之处入手，需找出解决此类不足之处的新方法。近来自体红骨髓移植治疗骨缺损的研究成为热点，研究表明自体红骨髓移植治疗骨缺损有它自身多方面优点[1,2]：取材操作方便、疗效确切以及并发症少等优点。本文作者亦准备从自体红骨髓入手，通过实验研究证实红骨髓治疗骨缺损的促进作用，期望发现红骨髓中治疗骨缺损的有效成分，为临床上治疗骨缺损提供相关证据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及相关材料：成年健康新西兰大白兔（蚌埠医学院实验中心），多孔磷酸钙骨水泥（PCPC，上海瑞邦生物科技有限公司），5810R垂直离心机（德国EPPENDORF公司），X线摄片仪（德国飞利浦制造）。

1.2 实验分组及模型制作：先后将60只大白兔（新西兰）均建立双侧桡骨1.5 cm的骨缺损实验模型。利用随机分组法将120侧桡骨骨缺损模型分为五组，分别为A、B、C、D、E组，每组24侧桡骨骨缺损模型，以E组作为实验对照组。A组：PCPC+自体红骨髓；B组：PCPC+骨髓单个核细胞；C组：PCPC+无细胞成分骨髓液；D组：PCPC+去上清液骨髓细胞成分；E组：单纯磷酸钙骨水泥。

1.3 试验方法：①红骨髓的获取：无菌操作下应用16号骨髓穿刺针穿刺抽取2.0 mL兔红骨髓，保存、备用。②制备骨髓单个核细胞：采用密度梯度离心法提取骨髓单个核细胞，保存、备用。③制备无细胞成分骨髓液、去上清液骨髓细胞：采用2000转/分钟的离心机将保存备用的兔红骨髓置于无菌抗凝试管中，离心时间达15 min，直至细胞成分和液体成分分层，分别留取、备用。④不同复合物的制备：将PCPC放置于装有自体红骨髓的无菌试管中（抗凝），抽取试管内气体，使管内形成负压，并置于恒温水浴箱中，让其充分浸润混合制成PCPC+ARBM复合物。并参照PCPC+ARBM的制备方法制备出不同复合物，如PCPC+去上清液骨髓细胞，PCPC+单个核细胞，PCPC+无细胞成分骨髓液。⑤手术过程：将兔以20%乌拉坦（5 mL/kg）静脉麻醉后，仰卧位，常规消毒铺巾，无菌条件下手术显露双侧桡骨中断，连同骨膜切除桡骨1.5 cm，造成节段性骨缺损模型[3]。然后分别于桡骨缺损处植入不同的事先准备好的复合物，移植好复合物后仔细缝合伤口，并包扎。⑥结果观察：分别于4、8、12周观察：a.大体解剖学观察。b.X摄片检查：观察家兔术后精神状态、进食、活动和伤口愈合情况；术后4、8、12周摄X线片，根据Lane-Sandhu等（1987年）的X线评分标准对各组移植区骨形成、骨连接和骨塑形进行评分。c.组织学观察：将取材的各组标本置于10%中性甲醛中固定，脱钙，石蜡包埋，以缺损区为中心水平位切片，HE染色，光镜下观察新骨生成情况。

1.4 统计学分析方法：所有采集的数据均应用SPSS13.0统计软件包进行处理，采用多个样本均数的两两比较（F检验）。

2 结 果

2.1 大体解剖学观察：术后第4周时，A组骨缺损处可见大量淡红色质硬纤维组织充填，植入物表面可见大量纤维骨痂，植入物与自体骨结合处模糊，结合尚不牢固；B、C、D三组骨缺损处部分淡红色质硬纤维组织填充，少量纤维骨痂，界限尚清，与自体骨结合不牢固；E组骨缺损处大量质软纤维组织充填，与自体骨界限清晰。

术后第8周时，实验组骨痂明显多于对照组，A组（A组植入物表面大量坚硬的连续骨痂成膨胀性生长，植入物表面的腔隙已被充填，植入物和自体骨结合牢固）；B、D组（组植入物表面部分被骨组织覆盖，植入物与自体骨界限模糊，结合欠牢固）；C组以上表现比B、D两组差；E组可见少量反应性骨形成。

术后第12周，A组（组缺损处均完全被骨组织覆盖，呈骨性愈合，骨缺损完全愈合）；B、C、D（各组植入物表面可见大量坚硬的连续骨痂生长，植入物与自体骨结合牢固），E组缺损两端部分硬骨痂充填，结合欠牢固。

2.2 X线摄片检测：术后第4周时，A组骨缺损处表面模糊，骨痂形成，人工骨少量吸收，B、C、D三组缺损处两端可见部分骨痂形成，植入物无吸收；E组骨缺损处未见明显骨痂形成，植入物无吸收。

术后第8周时，A组（骨缺损处可见大量连续骨痂生成，包裹植入物，连接截骨断端，密度增加，人工骨大部分吸收，骨髓腔可见再通）。B、D组骨缺损处可见部分连续性骨痂形成，植入物两端模糊，密度有所增高，植入物少量吸收，其中C组较B、D两组稍差，植入物轮廓可见。E组可见少许反应性骨痂形成，植入物无吸收，髓腔两端硬化封闭。

术后第12周时，A组（缺损处可见新生皮质骨改造塑型完成，新生骨密度接近正常骨组织，与自体骨自然连接，人工骨基本吸收，骨髓腔基本再通）植入物与骨端融合，形成新的骨皮质且光滑，骨缺损完全修复且可见部分髓腔再通影像。B、D组（缺损处可见大量连续骨痂形成，完全包裹人工骨，皮质骨基本连续，人工骨大部分吸收，骨髓腔部分再通），C组表面可见大量连续骨痂形成，包裹植入物，皮质骨基本连续，植入物大部分吸收，骨髓腔少部分再通。E组可见反应性骨痂形成，髓腔封闭，植入物无吸收。

术后12周A组骨缺损完全修复、部分髓腔再通术后12周B组见骨缺损基本修复术后12周C组见大量骨痂形成、骨折线模糊；术后12周D组见骨缺损基本修复；术后12周E组见人工骨两端及近尺骨侧骨痂形成，骨缺损未修复。各时期各组Lane-Sandhu X线评分结果统计学分析（x¯±s）。注：各时期各组之间两两比较，除B、D组比较P值＞0.05，表示B、D组无显着性差异。其余各组之间两两比较P值＜0.05，表示有显着性差异。

2.3 组织形态学观察：术后4周时，A组植入物孔隙内及边缘可见大量软骨细胞及成骨细胞，外周的新生软骨以及不成熟的骨小梁覆盖部分植入物，缺损两端大量成骨，植入物内还可见新生毛细血管形成；B、C、D组植入物间隙内可见大量纤维组织，部分软骨细胞和成骨细胞，外周的新生骨痂形成，但不连续，包裹少部分植入物，截骨两端大量成骨，植入物内偶可见新生毛细血管。E组植入物间隙内可见大量纤维组织，少量软骨细胞和成骨细胞，缺损区与自体骨界限清楚。

术后8周时，A组（植入物内可见大量新生骨组织，且可见破骨细胞形成，新生骨逐渐取代人工骨，可见少量骨髓组织，植入物表面新生骨痂片状增生，包裹大部分植入物表面，新生骨痂与缺损两断端连成片状；B、D组植入物内可见新生骨，并有可见大量破骨细胞形成，新生骨逐渐取代植入物，植入物内可见新生毛细血管，表面可见大量新生骨痂增生成条索状，包裹部分人工骨。C组植入物内可见新生骨，并可见部分破骨细胞，新生骨部分取代植入物，骨内可见少量新生毛细血管形成。E组截骨两端附近植入物间隙内可见软骨细胞和成骨细胞。

术后12周时，A组植入物孔隙内可见大量成熟骨组织，植入物大部分被吸收，且可见大量骨髓组织形成。植入物与新骨间可见大量成熟骨小梁通过，其间可见新的哈佛系统，编织骨改建成板层骨。B、D组植入物内可见部分成熟骨组织、成骨细胞及破骨细胞，植入物大部分被吸收，可见骨髓组织，表面可见部分皮质骨包裹，且与自体骨形成片状连接，C组人工骨间隙内少量成熟骨组织，成骨细胞和破骨细胞，人工骨部分被吸收，可见少量骨髓组织，见原始骨髓、骨髓腔形成；E组植入物内少量新生骨，骨缺损区与自体骨界限略模糊。A、B、C、D、E组术后12周，HE染色。

3 讨 论

治疗骨缺损一直都是骨科界的棘手问题之一，现在大家公认的治疗骨缺损的“金标准”方法是自体骨移植，但因为自体骨移植存在一定程度的缺陷，如自体骨来源有限，不能满足临床对其数量上的需要，且存在供骨区的损失及后遗症。其他方法如：同种异体骨移植以及生物材料的应用，但都存在不同程度的缺点。如同种异体骨的缺点：新骨生成能力低、被吸收率高、血管化程度差及免疫排斥反应会导致失败。生物材料虽可避免免疫排斥反应，但无诱导成骨作用。近年来，对于骨缺损修复研究的热点集中在组织工程骨以及生长因子与组织工程骨的结合。

应用自体红骨髓局部注射治疗骨不连，将红骨髓注入骨不连断端处，在断端周围形成血肿，连接骨折断端，进而机化并有新生血管生成，断端周围形成大量间质细胞，从而促进骨不连修复。由于自体红骨髓ARBM中含有大量骨形态发生蛋白（BMP）、骨髓基质干细胞、骨内膜细胞和骨祖细胞，另外骨髓中含有的单核细胞及血小板等还能产生促进骨愈合的生长因子[4]。骨髓中的成骨能力来源于有形成分中的骨髓基质干细胞，BMSC以两种形式存在，第1种是IOPC，在因子的诱导作用下分化为成骨细胞，从而促进成骨；第2种是DOPC，直接定向分化为成骨祖细胞，进而促进成骨，BMSC即使在体外脱离诱导物培养条件下也能成骨[5]。骨髓基质干细胞与成骨细胞在生长因子的作用下大量增殖，胞外基质合成增加。实验研究发现[6]兔自体红骨髓中存在多种促进骨折愈合的生长因子，例如：BMP-2、成纤维生长因子-b、转化生长因子- beta、胰岛素样生长因子-1、血管内皮细胞生长因子-165、血小板衍生生长因子-BB，且骨髓中的含量明显高于外周血液，另外通过此研究发现含有生长因子的红骨髓上清液可诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化。

磷酸钙骨水泥（PCPC）是组织工程骨支架材料研究的热点，它是一种在化学组成上与骨组织的无机成分相同的骨缺损支架材料，它不仅具有优良的骨传导性，而且具有骨诱导性[7]。

PCPC是上海瑞邦生物科技有限公司研制的成品[1]。PCPC所具有的优点[8]：①人工制备、数量充足。②形态塑造性强。③凝固过程中不产热。④具有较好的孔径及孔隙率，为新骨的长入和增殖提供了良好的结构[9]。⑤生物相容性和安全性高[10-12]。⑥体内可降解性且降解产物无毒性[13]。⑦强度合适：强度在松质骨与皮质骨之间，适用于骨缺损支架材料。

本实验结果证实了ARBM复合PCPC可以促进骨缺损的修复；ARBM中的骨髓单个核细胞和骨髓上清液均对骨缺损修复起到促进作用，主要以骨髓单个核细胞促进骨修复的作用为主。同时，实验结果也证实PCPC具有的体内可降解性、良好的生物相容性及生物安全性构等优点。为临床上应用ARBM移植治疗骨缺损或骨不连提供了实验依据。虽然如此，但还有很多研究工作需要我们去做，如ARBM治疗骨缺损的用量多少问题；ARBM和载体材料复合方法的进一步研究；另外，如何使得PCPC在孔隙率、孔径大小和机械强度之间找到一个完美的平衡点，都将是我们以后研究的课题。

[1] Okuda T,Uysal AC,Tobita M,et al.Prefabrication of tissue engineered bone grafts: an experimental study[J].Ann Plast Surg,2010,64(1):98-104.

[2] Wilmowsky C,Schwarz S,Kerl JM,et al.Reconstruction of a mandibular defect with autogenous autoclaved bone grafts and tissue engineering: An in vivo pilot study[J].Biomed Mater Res A,2009,88(1):126-132.

[3] Nishitani K,Shirai T,Kobayashi M,et al.Positive effect of alendronate on subchondral bone healing and subsequent cartilage repair in a rabbit osteochondral defect model[J].Am J Sports Med,2009,37(Suppl 1):139S-147S.

[4] Dudas JR,Losee JE,Penaseino VM,et al.Leporine derived adipose precursor cells exhibit in vitro osteogenie potential[J].J Craniofae Surg,2008,19(2):360-368.

[5] Borrelli J Jr,Rrickett WD,Ricci WM.Treatm ent of nonunoins and osseous defectswith bone graft and calcium sulfate[J].Clin Orthop Relat Res,2003,411(2):245-254.

[6] 许克庆.兔红骨髓中成骨性生长因子的测定及体外诱导成骨的研究[D].蚌埠:蚌埠医学院,2011.

[7] 朱容.CPC的制备、表征与荧光示踪研究[D].海口:海南大学,2010.

[8] EI-Amin SF,Lu HH,Khan Y,et al.Extracellular matrix production by human osteoblasts cultured on biodegradable polymers applicable for tissue engineering [J].Biomaterials,2003,24(7):1213-1221.

[9] 王磊,李耀俊.新型多孔磷酸钙复合骨髓基质干细胞组织工程实验研究[J].华西口腔医学杂志,2010,8(3):315-318.

[10] Sculean A,Windisch P,Szendroi-Kiss D,et al.Clinical and histologic evalu-ation of an enamel matrix derivative combined with a biphasic calcium phos-phate for the treatment of human intrabony periodontal defects[J].J Periodontol,2008,79(10):1991-1999.

[11] Lind-Hansen T,Nielsen PT,Petruskevicius J,et al.Calcium phosphate cement enhances primary stability of open-wedge high-tibial osteotomies[J]. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc,2009,17(12):1425-1432.

[12] Chen HW,Huang HB,Zhao GS,et al.Treatment of chronic osteomyelitis with antibiotic-loaded calcium phosphate cement[J].China J Orthop and Trauma,2008,21(1):79-81.

[13] Ooms EM ,Wolke JG,van de Heuvel MT,et a1.Histological evaluation of the bone response to calcium phosphate cement implanted in cortical bone[J].Biomaterials,2003,24(6):989-1000.

The Experimental Study of Autologous Red Bone Marrow and the Different Composite Components PCPC Repairing Bone Defect

FANG Yong, XIAO Yu-zhou, LIAO Zhong-ya
(Department of Orthopedics, Bozhou People’s Hospital, Bozhou 236800, China)

ObjectiveTo discuss the efficacy treatment by autologous red bone marrow (ARBM)and various components composite porous calcium phosphate cement (PCPC)bone defect in order to find the evident of autologous red bone marrow healing role in the bone defect. Through this study we provides experimental evidence for the clinical treatment about bone defects red bone marrow transplant.MethodWe select 60 healthy New Zealand white rabbits, weighing 2.5～3.0 kg. All animals were established experimental model of bilateral bone defect(1.5 cm). All animals were completely random divided into A, B, C, D, E according to forelimbs(24 side per five groups), which E was the control group. A group was implanted autologous red bone marrow in the bone defect site. Group B was implanted bone marrow mononuclear cells. Group C was implanted composite acellular components; D group was implanted composite bone marrow supernatant cell components; E group was implanted with simple PCPC. we get the samples 4、8 and 12 weeks in each group at each time point and six rabbits were randomly selected(three killed, three under anesthesia)to get X-ray exam, the killed three rabbits receive histological examination such as various periods of new bone formation. We make statistical analysis according to modified Lane-Sandhu X scoring and histological score.ResultThe gross anatomy, x-ray and histological observation at all time points showed that the bone cells, trabecular bone matrix, bone remodeling, and PCPC degradation inside the implant, ARBM the composite of artificial inoculation (PCPC)group was better than the other groups. Lane-Sandhu X ray and histological score has statistically significant difference (P＜0.05).ConclusionAutologous red bone marrow and growth factors have the effect on promoting bone defects as well as a synergistic effect in promoting bone defect repair process. Autologous red bone marrow can be used in the treatment of bone defect repair which the main-promoting ingredients was the bone marrow mononuclear cells.

Calcium phosphate bone cement; CPC; ARBM; Autologous red bone marrow; Bone marrow mononuclear cells; Bone defect; Porous

R68

B

1671-8194（2014）28-0088-03