弓形虫病诊断技术及检测
2014-01-27李继林许保军
李继林 许保军
(1.江苏省盱眙县古桑乡畜牧兽医站,江苏淮安 211701;2.江苏省盱眙县桂五镇畜牧兽医站,江苏淮安 211721)
弓形虫病是由原生动物寄生虫刚地弓形虫引起的一种人兽共患性动物传染病。刚地弓形虫(简称弓形虫)是一种人兽共患、专性细胞内原生动物寄生虫;它对所有温血动物都有感染性。
1 病原鉴定
1.1 病原分离
用接种实验鼠的方法可以很好地将弓形虫从流产绵羊和山羊的胎儿及胎膜中分离出来。最好的接种材料是胎儿脑组织和胎盘子叶,用无污染的新鲜样品可得到很好的实验结果。任何时候都不能将样品冰冻,因为这样会杀死该寄生虫。
1.2 组织切片
在死于急性弓形虫病的动物中,许多组织包括肝、心和肺脏有局灶性单核炎症或伴局部坏死。肺脏有时有水肿。淋巴结有时肿大,可伴有出血性或非出血性坏死。尤其在坏死区与炎症区可检出弓形虫速殖子。
1.3 饮水中卵囊检测
利用检测隐孢子虫卵囊的方法,已经在饮水中检出了弓形虫卵囊。该方法需要采集大体积的水样并将水样通过柱状滤器。鉴别弓形虫卵囊的方法是接种裂齿动物。
2 血清学试验
有多种血清试验可用于检测弓形虫抗体。(1)观察者是在显微镜下判断速殖子出现的颜色。例如,染色试验(DT)或IFA试验。(2)根据速殖子、血红细胞或胶乳颗粒的凝集原理建立起来的试验,例如,与它们对应的直接凝集试验、间接血凝试验(IHA)和胶乳凝集试验。ELISA是依据颜色变化的程度来界定一定溶液中特异性抗体的数量。
2.1 DT是人弓形虫血清学试验的所谓“金标准”
将活弓形虫速殖子加补体样辅助因子和加待检血清在37 ℃孵育1 h,然后加亚甲蓝。特异性抗体使寄生虫膜具有通透性,致使原生质溢出而速殖子不与染料结合,故呈无色。未暴露于特异性抗体的(即阴生血清样品)的速殖子吸收染料而呈蓝色。DT试验对人弓形虫检测特异而敏感,但对其他动物的弓形虫检测可能不可靠。此外,由于使用活虫,因此DT具有潜在的危险性。该试验费用大且有很高的技术要求。值得注意的是,从动物福利考虑,速殖子应尽可能在组织培养基中培养,不要在小鼠腹膜内培养。
2.2 IFA是一种简单而被广泛使用的方法
完整的灭活的速殖子与经稀释的被检血清一起孵育,加适量的荧光抗该物种血清,然后用荧光显微镜检查结果。适用于各种动物的荧光素标记抗体已商业化,该方法费用较低,且试剂盒可在市场上买到。但是这种方法需要荧光显微镜,以肉眼判读结果,会因人而异。找到某些物种特异性轭合物可能较为困难,且存在与风湿性因子和抗核抗体交叉反应的危险。
2.3 DAT既敏感又特异
将福尔马林处理过的速殖子加于U形微量板,然后加进稀释的血清。阳性样品会凝集并可评出级别,而阴性样品则会在孔底部产生一个析出的速殖子“钮扣”。尽管该试验需要较多的抗原,但是它简单且易于操作。市场上有商品试剂盒。后面介绍弓形虫的培养和收获方法。市场上也有商品LAT试剂盒。DAT和LAT没有种特异性,适用于各种动物。
最初使用是由弓形虫RH株速殖子制备的可溶性抗原,置于微量板孔中。待检血清(如采自绵羊)加进后,再加抗物种标记酶轭合物如过氧化酶标记的抗绵羊IgG。任何粘附的轭合物都引起底物变色,底物颜色变化与直接结合的抗体量有关,并可用分光光度计在对应于所用底物吸收值下判读。该试验简便,可检测大数量样品,而且用所选种特异性轭合物,操作容易。种特异性轭合物、底物和全套试剂盒均可在市场买到。但该试验需要分光光度计。
需要分析大量样品的实验室很适合使用ELISA。近年来,一种动力学ELISA(KELA)已经被建立。KELA系统测定结合酶和产生颜色的底物溶液之间的反应率。以每45 s读一次阅读3种光密度(OD)(利用KELA数据管理程序),以斜率(slope)方式显示出结果。ELISA和KELA之间的相关性非常高,因此,这2个试验都是非常好的诊断工具,只是它们应用的方便性不同。
为了提高常规ELISA的特异性,使用重组抗原及亲和纯化的弓形虫特异抗原的ELISA试验已经被建立,可用于绵羊检测。但这些试验没有被常规应用。
以常规ELISA对弓形虫特异抗体IgG和IgM的检测会出现急性和慢性弓形虫之间的差异。目前,已经建立起亲合力试验。由于免疫应答发育成熟,所以,抗原的增加亲合力(功能性亲合力)抗体在感染发生之后产生。这种亲和力可以被检测出来,并可用于确定弓形虫感染是活跃期还是初期。一种检测绵羊弓形虫P30抗原的IgG亲和力的试验已经被建立。这个试验是一个将近期感染从更成熟的感染中相对地区别出来的好的诊断工具。
如果被检血清为阴性,由于伊文思蓝的自发荧光,全虫将显现红色。它们也可能在其端部出现绿色荧光帽(非特异性极荧光)。如果被检血清为阳性,虫体将显现红色荧光且在该孔中至少80%虫体被连续的绿色荧光带所围绕。对于成年绵羊或山羊样品,可以规定滴度≥1/64为阳性、滴度≤1/32为阴性;对于绵羊或山羔羊和胎羊血清,则分别为≥1/32和≤1/16。
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