血吸虫核受体的研究进展

邱春辉, 刘升发,洪 炀，张 旻，林矫矫

血吸虫病是由血吸虫引起的一种重要的寄生虫病，目前世界上大概有2亿人口受到该病原的威胁[1]。血吸虫主要寄生在宿主静脉内，为维持正常的生长发育以宿主的血液为食，并对宿主体内的分子信号做出反应[2]。部分荷尔蒙信号作为正常生理条件下血液的重要成分，在后生动物中通过核受体这一类重要的转录调控因子，在一系列重要的生化过程中发挥重要的作用，包括细胞分化和增殖[3-4]。虽然不同的核受体可以精确地调控各自相关基因表达，但它们含有共同的蛋白结构，包含一个N端-A/B区, 一个 高度保守的 DBD, 一个铰链区(D区)和一个C-端 LBD区。到目前为止，寄生于人体的6种重要血吸虫中：曼氏血吸虫已有21个核受体被鉴定，其中有14个核受体的全长cDNA已被克隆和研究；日本血吸虫也有3个核受体的全长cDNA已被克隆；而埃及血吸虫、湄公血吸虫、马来血吸虫、间插血吸虫还未见有关他们核受体成员的全长cDNA序列的文献报道[5-6]。

1 曼氏血吸虫核受体家族(NR)成员

曼氏血吸虫是一种寄生于哺乳动物终末宿主和螺类中间宿主，呈现雌雄分化、生活史复杂的吸虫。曼氏血吸虫是血吸虫病的一个重要的致病病原，血吸虫基因组测序已经证实，曼氏血吸虫核受体整个家族含有21个成员[7]。21个核受体的全长或者部分基因序列已经被分离出来。进化树分析显示，除了三个2DBD-NRs成员，曼氏血吸虫的核受体大部分都可以在后口动物和节肢动物中找到同源物。曼氏血吸虫核受体家族含家族1(NR1)成员6个，家族2(NR2)成员9个，家族4(NR4)成员1个，家族5(NR5)成员2个，二DBD家族(2DBD-NRS)成员3个，在家族3(NR3)和家族6(NR6)中未发现血吸虫核受体家族成员。在这21个曼氏血吸虫核受体成员中，已经有14个核受体的全长cDNA被分离和研究[5]。

1.1NR1A成员SmTRa和SmTRβ 两个与脊椎动物甲状腺激素受体同源的曼氏血吸虫SmTRa和SmTRβ，是原肢类动物中最先被鉴定出来的该类核受体[8]。GST-Pull down试验显示SmTRa和SmTRβ都可以与SmRXR1形成异源二聚体。这提示着非脊索动物的甲状腺激素受体可以与脊索动物的RXR样的甲状腺激素受体形成异源二聚体。凝胶迁移试验(EMSA)显示SmTRa可以以单体或二聚体的形式与以保守的DNA半位点AGGTCA寡核苷酸探针(DR0-DR5Pal0)结合,而SmTRβ与相应的DNA结合能力就比较弱[8]。虽然两个SmTR都可以与SmRXR1形成异源二聚体，但SmTRa/ SmRXR1和SmTRβ/ SmRXR1未能与检测的DNA作用元件结合。为了说明SmTRa是否能够与T3和T4配体结合，作者把曼氏SmTRs的LBD序列与其他物种的甲状腺激素受体序列进行了比对，发现保守性不是特别强，提示，SmTRs与T3和T4配体可能不能结合。但是SmTRs在基序一和基序二上都显示较强的保守性，有必要做相应的实验来回答该受体是否与相应的配体结合的问题。

1.2NR1E成员SmE78 Wu等在曼氏血吸虫得到了一个新的与果蝇蜕皮激素诱导蛋白78类似的核受体SmE78[9]。 对该受体在血吸虫各个发育时期的mRNA表达水平进行检测，结果表明其在虫卵和毛蚴阶段表达量较高。早前的研究表明曼氏血吸虫可以合成固醇类的蜕皮激素并且该激素可以有效地刺激血吸虫毛蚴在宿主体内的定殖[10-11]。血吸虫的核受体SmE78是否与蜕皮激素信号转导相关还需要试验的证实。

1.3NR1J成员SmCAR和SmHR96β Hu等获得了曼氏血吸虫CAR受体的基因全长序列，它在DNA结合区域包含一个典型的P-box,其与AGTGCA可高效结合。该基因与果蝇的核激素受体96(DHR96)同源，酵母双杂交和Pull-down 及免疫共沉淀试验显示SmCAR可以与SmRXR1结合，但不能与SmRXR2结合[12]。EMSA试验显示SmCAR可以与曼氏血吸虫的P14雌虫特异性基因上游序列结合。该受体在血吸虫各个发育时期的mRNA均表达，但在虫卵和毛蚴阶段表达量较高。SmCAR蛋白在雌雄虫的亚皮层和实质细胞中均有表达。另外在成熟雌虫的卵巢、虫卵和卵黄细胞中均有发现[13]。Wu 等[7]基于一个编码DBD结构域的部分cDNA序列鉴定出了与果蝇的核激素受体96(DHR96)同源另一个基因SmHR96β。

1.4NR1的其他成员 进化树分析显示SmNR1与NR1家族成员属于同类，但不属于任何组[14]。SmNR1有两个不同的剪辑方式，两个不同的剪辑都可以编码相同的氨基酸。荧光原位杂交显示SmNR1位于血吸虫一号染色体。酵母双杂交和GST-Pull down试验显示SmNR1可以和SmRXR1相互作用。EMSA试验显示SmNR1和SmRXR1异源二聚体可以与包含AGGTCA的DNA元件(DR0-DR5Pal0)结合，包括p14-DR17在内[15]。突变分析显示一个可以与SmFTZ-F1互作的共调控子SmCBP1能够介导SmNR1和SmRXR1的LBD区的相互作用[16-17]。瞬时转染哺乳动物COS-7细胞系显示SmNR1/SmRXR1可以提高DR2依赖的报告基因的转录激活作用[14]。

1.5NR2B成员SmRXR1和SmRXR2 曼氏血吸虫中存在两个哺乳动物RXR同源的SmRXR1和SmRXR2[18-20]。RXRs通过形成异源二聚体，在调控核受体活性和核受体信号通路中承担重要作用[20]。SmRXR1可以与很多蛋白形成异源二聚体。SmRXR1不但可以与包含AGGTCA的DNA元件(DR0-DR5Pal0)微弱地结合，还能够与SmP14基因的顺式作用元件结合[20]。SmNR1和SmRXR1异源二聚体可以与包含AGGTCA的DNA元件(DR0-DR5Pal0)结合[14]。QRT-PCR显示，SmRXR1在虫体各个阶段均有组成性的表达[20]。共调控子SmCBP1能够介导SmNR1和SmRXR1的相互作用[17]。

Freebern等成功扩增到了SmRXR-2基因，指出其在曼氏血吸虫体内可持续性表达，毛蚴和尾蚴中的表达量较高。但是SmRXR-2的蛋白表达情况与mRNA表达结果相反，童虫中该蛋白的表达量最高，而毛蚴和尾蚴中相比则低的多[18-19]。Fantappie 等针对曼氏血吸虫RXR受体(SmRXR1和SmRXR2)特性及组织分布表达进行了研究[21]。与SmRXR1不同，SmRXR2无法与SmTRa、SmTRb、SmCAR和SmNR1形成异源二聚体。SmRXR2无法与保守的直接重复反应元件结合，虫体天然的SmRXR2蛋白也不能转录激活哺乳动物细胞中的基因报告基团[19]。但是，酵母杂交实验显示SmRXR2可以与曼氏P14上游区域的顺式元件相结合。酵母双杂交及免疫共沉淀显示SmRXR1和SmRXR2无法形成二聚体[21]。

1.6NR2C成员 SmTR2/4 SmTR2/4(睾丸孤核受体2/4)在曼氏血吸虫体内可持续性表达，其中尾蚴中的表达量最高。免疫印记分析得到两个SmTR2/4蛋白的同工异构体，分子量大小分别为230和245道尔顿。EMSA试验显示SmTR2/4的DBD结构域可以与包含两个AGGTCA的DNA元件(DR3和DR4)结合。酵母单杂交显示A/B,D和F区各自都含有转录激活的特性[22]。

1.7NR4A成员SmNR4A Wu等在曼氏血吸虫得到了一个新的核受体亚家族成员SmNR4A，该受体因在LBD结构域含有4个保守的苯基丙氨酸，推测其可能为孤核受体。QRT-PCR显示SmNR4A在子胞蚴阶段和35天成虫中表达量最高[23]。

1.8NR5A成员SmFTZ-F1a Lu 等在2006年分离鉴定了一个属于NR5A家族的SmFTZ-F1a核受体，半定量RT-PCR显示该基因在虫卵阶段的表达量最高。免疫印记分析得到分子量大小分别为206和120道尔顿的蛋白[24]。EMSA试验显示SmFTZ-F1a可以以单体形式与能被类固醇发生因子(SF-1)识别的FF1RE反应元件结合[25]。酵母单杂交实验显示SmFTZ-F1a转录激活报告基因的表达是A/B区域依赖性的。

1.9NR5B成员SmFTZ-F1 进化树分析表明SmFTZ-F1属于NR5B家族成员。目前已经鉴定出两个SmFTZ-F1的可变剪辑。RT-PCR显示SmFTZ-F1在各个阶段均有表达，在毛蚴、胞蚴和尾蚴阶段的表达量较高。但蛋白是在尾蚴、童虫和雄性成虫阶段的表达量比较高。EMSA试验显示SmFTZ-F1可以与SF-1的反应元件和SFRE的DR0结合，但不能和DR1、DR2、DR3、DR4及DR5结合。SmFTZ-F1可以激活转录哺乳动物细胞系的一个报告基团[26]。Bertin 等研究显示SmFTZ-F1孤核受体的D、E和F区可以特异性地与SmRXR1的LBD相作用，暗示NR5B家族成员可以与其结合形成二聚体[27]。共转CV-1细胞显示SmFTZ-F1和SmRXR1能共激活转录，但只有SmFTZ-F1能结合到启动子区域[26]。功能分析显示SmCBP1能与SmFTZ-F1相互作用[16]。

1.102DBD-NRs家族成员Sm2DBD-NRa、Sm2DBD-NRβ和Sm2DBD-NRr 曼氏血吸虫核受体的一个最显著特点是分离出一个新的家族，这个家族包含了两个DBD结构域和一个LBD结构域[7,28]。荧光原位杂交显示这三个2DBD-NRs家族成员分别定位于不同染色体。RT-PCR显示：Sm2DBD-NRa在胞蚴、尾蚴、童虫、雌虫和雄虫阶段能检测出来；Sm2DBD-NRβ在虫卵、胞蚴、尾蚴和雄虫阶段表达量相对较高；而Sm2DBD-NRr只在尾蚴和28天虫体中能检测到。酵母双杂交显示，Sm2DBD-NRa可以形成同源二聚体，但是未能与SmRXR1和SmRXR2形成异源二聚体。GST-Pull down试验证实了在体外Sm2DBD-NRa的LBD区可以形成同源二聚体[28]。Sm2DBD-NRa以同源二聚体的形式相互作用，暗示了四个P-盒都与DNA的结合相关，2DBD-NR结合靶基因顺式元件可能利用了新的DNA结合机制。

2 日本血吸虫核受体家族(NR)成员

Wu等认为与曼氏血吸虫相比，日本血吸虫除了多一个到两个2DBD-NR家族成员外，其他核受体的成员与曼氏血吸虫的类似[7]。而刘峰等[29]在日本血吸虫序列中发现类固醇激素受体(GR)，蜕皮激素样受体(EcR)和雌激素相关受体(ERR)。这些受体在曼氏血吸虫中是不存在的。Wu等重新分析了日本血吸虫的基因组DNA序列后认为日本血吸虫“蜕皮激素样受体”是曼氏血吸虫同源的CAR受体；而日本血吸虫“雌激素相关受体”实际不是核受体[5]；至于日本血吸虫“类固醇激素受体”(Sjp_0026760, Sjp_0002350)实际上是与曼氏血吸虫同源的RXR1受体。

2.1NR1A成员SjTHRβ Qiu[30]等通过RACE技术从日本血吸虫中成功扩增到SjTHRβ的cDNA序列，并且体外原核表达了SjTHRβ-DBD和SjTHRβ-LBD重组蛋白。经EMSA试验显示SjTHRβ-DBD可以与保守的DNA半位点AGGTCA寡核苷酸探针结合。体外原核表达的rSjTHRβ-LBD蛋白可以在一定程度上保护小鼠免受日本血吸虫尾蚴的感染。

2.2NR2B成员SjRXR1和SjRXR2 Qiu[31-32]等通过RACE技术从日本血吸虫中成功扩增到SjRXR1和SjRXR2的cDNA序列。他们体外原核表达了SjRXR1-LBD重组蛋白并制备了该蛋白的多抗血清。该试验推测真核表达的SjRXR1-LBD蛋白，可能可以与9-cisRA结合[31]。

3 结 语

目前曼氏血吸虫、日本血吸虫和埃及血吸虫这三个物种的基因组测序都已经完成[29，33-34]。对比曼氏和日本血吸虫基因组中的编码核受体序列，发现这两个物种拥有类似的核受体成员[5,7]。但到目前为止，还没有有关埃及血吸虫的核受体成员的报道。同样地湄公血吸虫、马来血吸虫、间插血吸虫的核受体成员也未见相关报道。

学者们试图通过研究激素对寄生虫的作用，来阐述哪种激素对血吸虫的生长发育有直接的影响，及是否通过激素受体起作用。因配体结合受体特异性的存在，为精确地干扰寄生虫生化途径提供了可能，这意味着这些核受体蛋白有可能作为潜在的药物靶标。曼氏血吸虫、日本血吸虫和埃及血吸虫基因组测序的相继完成，对研究者们理解血吸虫的核受体的进化及其功能方面提供重要基础。尽管Wang等[35]在生物学、药理学及结构特性方面对寄生线虫核受体DAF-12的作用通路做了探讨和报道，但我们对寄生虫核受体和其调控子的生物学功能和作用机制的了解还是很不充分的[36]，还有待于继续深入研究。

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