金黄色葡萄球菌中mecA基因的检测及其耐药相关性＊

陈小凤，彭 洋，毕嘉琪，姚振江

（广东药学院／广东省分子流行病学重点实验室，广东广州 510310）

金黄色葡萄球菌中mecA基因的检测及其耐药相关性＊

陈小凤，彭 洋，毕嘉琪，姚振江△

（广东药学院／广东省分子流行病学重点实验室，广东广州 510310）

目的探讨mecA基因在临床分离金黄色葡萄球菌（SA）中的表达水平与耐药的关系。方法收集临床分离的SA菌株186株，采用纸片扩散法（K-B法）进行药敏试验，并提取DNA，运用PCR扩增mecA基因。结果耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的检出率为30.65%（57／186），其中56株 MRSA和129株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）中有10株检出mecA基因阳性；除对万古霉素、利奈唑胺敏感外，MRSA对其他抗菌药物耐药率均高于MSSA，携带mecA基因的菌株抗菌药物耐药率高于不携带mecA基因的菌株，两组差异有统计学意义（P＜0.05）。结论SA临床分离菌株中含mecA基因的菌株对多种抗菌药物耐药，可见mecA基因在SA的耐药机制中发挥着重要作用。

金黄色葡萄球菌；mecA基因；耐药

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是当今抗感染治疗的难题，其对包括甲氧西林在内的多种抗菌药物耐药，具有多重耐药性［1］，已引起临床和实验室的广泛关注［2］。mecA基因是金黄色葡萄球菌（SA）耐药机制中的重要基因，掌握临床分离SA耐药性与mecA基因的关系，能给临床用药提供参考。本研究分析了广州某三甲医院临床分离的186株无重复SA菌株的来源、耐药监测情况并对其进行了mecA基因检测，以期探讨该基因与SA耐药性的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 186株菌株来源于2012年1～12月广州某三甲医院住院患者各种临床标本中分离的SA，标本包括痰液、血液、脓液、穿刺液、引流物及胸、腹腔积液等，且无重复分离株，经生物梅里埃全自动细菌鉴定仪（VITEK 2）系统鉴定为SA。

1.2 方法

1.2.1 药物敏感性实验 采用纸片扩散法（K-B法）完成18

种抗菌药物的药物敏感性实验，测试SA对抗菌药物的敏感性。实验操作和结果判读严格按照美国临床实验标准化协会（CLSI）2012年标准。

1.2.2 DNA模版制备 根据文献［3］提供的方法，在LB肉汤中培养细菌过夜，离心菌液弃上清液加20mg／mL的溶葡萄球菌酶溶液和20mg／mL的蛋白酶K温孵（37℃，1h），然后经苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提，乙醇沉淀取上清液得到纯化的DNA。

1.2.3 PCR检测mecA基因 参照文献［4］设计，用PCR方法扩增mecA基因的特异性引物 mecA1：5′-TGG CAT TCG TGT CAC AAT CG-3′；mecA2：5′-CTG GAA CTT GTT GAG GAG AG-3′。扩增反应总体积为25μL：2×Taq PCR Master-Mix 12.50μL，10μmol／L引物上下游各1.00μL，双蒸水8.50 μL，DNA模板2.00μL。扩增条件：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃ 退火30s，72℃延伸60s，进行30个循环，最后72℃延伸10min。取PCR扩增产物5.00μL点样于1.50%琼脂糖凝胶中，80V电泳30min，紫外凝胶成像系统下观察结果并拍照，以标记物100bp LadderⅡ作为参照，阳性标本可在约310bp处观察到电泳条带。

1.2.4 PCR产物测序 随机挑取若干株阳性PCR扩增产物由上海生工生物工程有限公司进行纯化测序。测序结果经BLAST程序（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST／）进行比对确定其均为mecA基因。

1.3 统计学处理 应用SPSS20.0软件进行统计学分析，对相关数据进行χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 186株SA对18种抗菌药物的耐药率比较［株（%）］

2 结 果

2.1 菌株检出情况 在临床分离的186株SA中，苯唑西林抑菌环直径小于或等于10mm的MRSA有57株（30.65%），≥13mm的 MSSA有129株（69.35%）。

图1 部分临床分离株mecA基因PCR扩增电泳图

2.2 186株SA对18种抗菌药物的耐药率比较 药敏试验结果显示，186株SA中只有4株对18种抗菌药物敏感，仅占全部临床分离菌株的2.15%，186株SA对左氧氟沙星、阿莫西林／克拉维酸、克林霉素、青霉素类（青霉素G、氨苄西林）、红霉素、四环素的耐药率较高，表明SA对这几类抗菌药物耐药情况较为普遍。MRSA对多类抗菌药物耐药率较高，对青霉素G、苯唑西林高达100.00%，呈多重耐药特征；而 MSSA的耐药率相对较低，二者比较差异有统计学意义（P＜0.05），未发现有耐万古霉素、利奈唑脘的SA。mecA阳性（＋）临床分离菌株除对万古霉素、利奈唑胺敏感外，对庆大霉素、亚胺培南、环丙沙星、青霉素G、阿莫西林／克拉维酸、氨苄西林、苯唑西林、复方新诺明、克林霉素、利福平、氯霉素、四环素、头孢唑啉、红霉素的耐药性均高于mecA阴性（－）菌株，二者比较差异有统计学意义（P＜0.05）；mecA－的菌株均对复方新诺明、万古霉素、利奈唑胺敏感，见表1。

2.3 mecA基因检测结果及菌株分布情况 186株SA中检出mecA基因阳性66株，主要分布在神经内科（15株）、综合科（14株）和ICU（7株）等科室；标本类型包括痰液47株、各种脓液11株、血液3株和其他5株。在57株MRSA中，56株携带mecA基因，占98.25%；部分临床分离株mecA基因PCR产物电泳结果见图1。只有1株MRSA临床分离菌株未检测到mecA基因；而在129株MSSA中有10株（7.75%）携带mecA基因，二者比较差异有统计学意义（χ2＝141.413，P＜0.05）。

3 讨 论

目前，SA是引起临床感染的重要病原菌之一，特别是MRSA感染，正以惊人的速度在世界范围内蔓延和流行，且具有多重耐药的特点。MRSA产生的主要原因是由于SA通过mecA基因大量表达一种青霉素结合蛋白2a（PBP2a），使其与β－内酰胺类抗生素不能结合而产生耐药。有研究发现，mecA基因是SA通过转座机制获得的外来基因，且SA较易获得此基因，故检测mecA基因可作为 MRSA鉴定的“金标准”［5］。有研究发现，不同的MRSA，虽然检测mecA基因阳性，但其耐药程度却不尽一致［6－8］。因此，进一步研究 MRSA耐药的分子机制，减少糖肽类抗生素的使用成为当前研究治疗MRSA感染的亟待解决的问题。

本研究结果显示，在临床分离的186株SA中，苯唑西林抑菌环直径小于或等于10mm的MRSA有57株（30.65%），≥13mm的 MSSA有129株（69.35%）。低于文献［9-10］报道的MRSA在50.0%以上水平。186株SA临床分离MRSA的检出率为30.65%，药敏结果显示，MRSA对多种抗菌药物的耐药率均高于MSSA，且两组间差异有统计学意义，与刘玉枝等［11］报道相似，可见 MRSA耐药非常严重，可用于临床治疗的抗菌药物种类越来越少。57株MRSA中，56株携带mecA基因，占98.25%（56／57）；而在129株 MSSA 中有10株携带mecA基因，与陈庆增等［12］报道相似，携带mecA菌株对14种抗菌药物的耐药性均高于不携带mecA菌株，差异有统计学意义（P＜0.05），由此可以发现携带mecA基因的在SA的耐药机制中发挥重要作用。虽然有1株MRSA未检出mecA基因，但其显示对苯唑西林耐药，可能是由于β－内酰胺酶及青霉素结合蛋白（PBPs）产生过多或PBPs的修饰所导致［13］。而10株检出mecA基因但对苯唑西林敏感的菌株，有可能与β－内酰胺类接触后，可转化为耐β－内酰胺类抗生素菌株，故应把携带有mecA基因的菌株，归为 MRSA［14－15］。因此，采用分子生物学方法检测mecA基因的存在情况来鉴定MRSA是目前较理想的方法。尽管未发现对万古霉素耐药的菌株，但186株SA中只有4株对18种抗菌药物敏感，仅占全部临床分离菌株的2.15%，提示SA临床分离菌株存在严重的耐药性。

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Detection of mecA gene in Staphylococcus aureus and its correlation with drug-resistance＊

ChenXiaofeng，PengYang，BiJiaqi，YaoZhengjiang△
（GuangdongPharmaceuticalUniversity／GuangdongProvincialKeyLaboratoryof MolecularEpidemiology，Guangzhou，Guangdong510310，China）

ObjectiveTo investigate the mecA gene expression lvevl in clinically isolated Staphylococcus aureus（SA）strains and its correlation with drug resistance.MethodsClinically isolated 186SA strains were collected.The K-P method was adopted to conduct the durg sensitivity test.Then DNA of these strains was extracted and the mecA gene was amplified by using PCR.Results

The detection rate of methicillin-resistant SA（MRSA）was 30.65%（57／186），the positive mecA gene was detected in 56strains of MRSA and 10strains of methicillin susceptible S.aureus（MSSA）among 129strains of MSSA；except susceptible to vancomycin and linezolid，the resistance rate of MRSA to ther antibacterial durgs were higher than that of MSSA，the resistance rate to antibacterial durgs in the strains carrying mecA gene was higher than that in the strains without carrying mecA gene，ther difference between them had statistical significance（P＜0.05）.ConclusionClinically isolated SA strains carrying mecA gene are resistant to multiple antibacterial drugs，which indicating that mecA gene play an important role in SA drug-resistance mechanism.

staphylococcus aureue；mecA gene；drug resistance

10.3969／j.issn.1671-8348.2014.11.011

A

1671-8348（2014）11-1312-03

广东省自然科学基金资助项目（S2011010002481）。

陈小凤（1987－），在读硕士研究生，主要从事分子流行病学研究。△

，Tel：（020）34055806；E-mail：zhjyao2001＠yahoo.com。

2013-09-28

2013-11-30）

论著·基础研究