γ-分泌酶在阿尔茨海默病发病中的作用及与神经型尼古丁受体关系

任家谋 齐晓岚 官志忠

(贵阳医学院分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 550004)

阿尔茨海默病(AD)是一种最常见的人类中枢神经系统的退行性病变，临床上将其定义为进行性认知功能的丧失和从中年期到晚年期缓慢发生的进行性记忆损伤〔1〕。病理学上以细胞外老年斑(SPs)形成及神经细胞内神经元纤维缠结(NFTs)为主要特征〔2〕，还伴有颗粒空泡变性(GD)、平野小体(HB)、神经元减少等〔3〕。本文就AD的发病机制及研究现状、γ-分泌酶在AD发病中的作用、神经型尼古丁受体与γ-分泌酶的关系及神经型尼古丁受体在其中的作用做如下综述。

1 AD的发病机制及研究现状

在欧美发达国家及我国，AD发病有增多的趋势。一般在65岁左右时，AD的发病率约为2%～5%，年龄75岁左右时，发病率约为10%，年龄到90岁时，AD发病率可高达35%～40%〔4〕。目前认为AD是由遗传学因素、环境因素和代谢因素等多种因素共同作用所引起的一种病理过程，涉及多种机制。

1.1β-淀粉样蛋白(Aβ)的异常沉积 AD的特征性病理标志之一是SPs形成。SPs主要是Aβ包括Aβ40和Aβ42沉积的结果〔5〕。因此脑内Aβ的产生、聚集和沉积被认为是AD发病机制的首要和中心环节。Aβ由淀粉样蛋白前体 (APP) 经过β和γ-分泌酶连续的蛋白酶裂解产生。γ分泌酶组分早老素(PS)包括PS-1和PS-2突变导致APP水平增加或APP裂解改变使Aβ超量产生是引起家族性早发AD的主要原因〔6〕。

1.2Tau蛋白异常磷酸化 Tau蛋白的高度磷酸化在促进AD患者神经细胞退行性变中起着关键作用〔7〕。Tau蛋白是一种含磷的蛋白质，正常成人Tau蛋白中磷酸含量为2～3 mol/g，而在 AD 患者中，Tau白蛋被异常过度磷酸化从而使Tau蛋白的磷酸含量增高至5～12 mol/g〔8〕，是正常含量的3～4倍。高度磷酸化的Tau蛋白可抑制微管蛋白的装配和降低神经元的运输效率，在AD的发生机制中有重要的作用〔9〕。

1.3胆碱能功能降低 乙酰胆碱(ACh)为促进学习记忆的神经递质。AD患者脑组织中胆碱能神经元数量减少，胆碱能受体密度降低，胆碱能活性与SPs数量呈负相关〔10〕。临床上用抗酯解酶药物降低胆碱酯酶的活性的活性来提高ACh的水平，可改善AD患者记忆力降低和定向障碍等症状〔11〕。DeKosky等〔12〕通过对轻度认知障碍(MCI)轻、中度AD患者和正常人脑内多个区域ChAT活性测定发现，MCI和AD患者ChAT水平与正常人无明显差异，仅在AD晚期ChAT水平降低。

1.4自由基学说 研究表明，AD患者大脑中自由基水平上升，包括超氧化物阴离子自由基、过氧化氢、脂质过氧化物和自由羰基等含量增加〔13〕。体外研究指出，活性氧促进Aβ的毒性和聚集，而Aβ也是自由基生成增多〔14〕。体内研究也表明，Aβ的沉积诱导自由基的产生，Aβ的神经毒性作用很大程度上由自由基所介导，而自由基增多又极大地促进了Aβ的沉积，造成一种神经细胞受损和功能紊乱的恶性循环状态〔15〕。

1.5生物膜性脂质和胆固醇代谢的改变 有研究结果指出AD患者脑组织神经膜中的神经节苷脂含量明显减少，其减少程度与神经元的丧失和神经元面积缩小有关〔16〕。近年研究表明，高胆固醇可增强APP代谢过程中β分泌酶的活性，使APP产生Aβ增多，降低胆固醇水平可使α分泌酶活性增强从而减少Aβ的生成〔17〕。既往的研究也表明使用降胆固醇合成药-司汀类药(statins)可上调细胞中α7尼古丁受体并具有神经保护作用〔18〕。因此，生物膜脂质的异常改变和胆固醇代谢改变与神经元的形态功能变化以及神经元的死亡有关，是AD发生、发展机制中不可忽视的重要因素之一。

2 γ-分泌酶在AD发病中的作用

引起AD发病密切相关的酶即 Aβ的代谢需要三种关键酶： α，β，γ-分泌酶。APP由α分泌酶Aβ区域内部Lys16-Leu17之间的肽键，产生分泌型的APP(sAPPβ)和C83片段，而C83片段又在γ-分泌酶的作用下产生较小的具有神经毒性作用的P3和胞内片段AICD，此为非淀粉样肽源性途径。而淀粉样肽源性途径则是由β-分泌酶裂解APP分子β部位的第一个氨基酸之前的肽键产生sAPPα和C99片段，再由γ-分泌酶切开C99片段中39～44之间的肽键，产生不溶性的完整的Aβ1～42/43，含有39～43个氨基酸。γ-分泌酶是产生Aβ的最后一步，对调节产生Aβ40 和Aβ1～42起着关键的作用〔19〕。Farfara等〔20〕首次证明γ-分泌酶在AD中具有双重作用。一种作用是裂解APP产生Aβ，另一种是调控小胶质细胞以清除Aβ的积聚及其神经毒性。研究表明，PS是γ-分泌酶亚族的催化剂，PS1与PS2能够减少小胶质细胞活性，二者和γ-分泌酶抑制剂一样能够抑制小胶质细胞基因表达，蛋白水平和迁移能力，这些变化也会降低可溶性Aβ的吞噬作用。所以目前该酶被认为是开发AD药物的重要靶点。

γ-分泌酶分子量约为200～250 kD，酶切位点位于低位的跨膜片段中间，生物化学研究表明γ-分泌酶复合体由早老蛋白(PS)，单过性跨膜蛋白(NCT)，整跨膜蛋白APH-1和PEN-2四部分组成〔21〕。

广泛表达定位于内质网和高尔基体腔隙的PS是γ-分泌酶活性所必需的，包括同源性为67%的两种同源异构体PS1和PS2。含有γ-分泌酶活性的催化位点的PS-1是由467个氨基酸组成的约为50 kD的整膜蛋白，由8个跨膜结构区域(TM)和一个大的亲水性环构成。TM6和TM7中各有一个保守的天冬氨酸。PS-1在TM6和TM7之间的细胞溶质环内水解形成相互关联的两部分：28 kD的N-端片段(NTF)和18KD的C-端片段(CTF)。每一部分贡献一个Asp活性位点形成γ-分泌酶活性中心。PS全蛋白(PS)是无活性的前体，水解后的NTF和CTF形成PS异二聚体具有活性，这与该酶的酶切位点位于APP的跨膜区是一致的〔21〕。

提高PS的表达并不能提高γ-分泌酶活性，因为PS含量的变化受到多种因素的影响例如Notch的反馈调节，所以在研究γ-分泌酶活性过程中单纯地测定PS的表达量并不能代表酶活性的变化〔22〕。Esler等〔23〕研究发现PS的异二聚体和NCT都特异性地结合γ-分泌酶抑制剂并且和γ-分泌酶活性有关，表明NCT也是影响γ-分泌酶的活性因素。抑制NCT的表达，会导致减少PS的CTF的形成和APH-1和PEN-2的表达，增加APP的C端片段，减少Aβ的生成。

跨越7个跨膜区的整膜蛋白APH-1，分子量约为30 kD。研究表明，过分表达的APH-1和NCT能形成稳定的而无活性的γ-分泌酶高分子复合体。通过对APH-1的氨基酸序列对比，发现APH-1在TM4中含有一个保守的氨基酸序列，用Asp取代首位的Gly将会使APH-1产生失去功能的突变，影响-分泌酶复合体的活性，表明TM4中小的疏水结构的Gly促进生成活性γ-分泌酶复合体〔24〕。

PEN-2是一个有101个氨基酸组成的发夹样的整膜蛋白，分子量约为12 kD，有两个疏水的跨膜区，在切割各种Ⅰ型跨膜蛋白有重要的作用。PEN-2的N端和C端与γ-分泌酶复合体的各组成部分在内腔相互作用，包括NCT的外功能区，PS和APH-1的细胞外环。PEN-2的C端与PS相互作用，促进NCT成熟和PS的内切蛋白酶解，促进Aβ分泌〔25〕。

龙志敏〔26〕取成年痴呆小鼠的脑组织进行r免症荧光双标，结果显示：痴呆小鼠脑部各区均出现大量的Nct阳性细胞(绿色荧光)和Aβ阳性细胞(红色荧光)，但在大脑皮质和海马内NCT阳性神经元的数量要多于Aβ阳性细胞，且在一些神经元内NCT与Aβ出现共存。免疫荧光双标结果显示：PS1在成年双转基因痴呆小鼠脑组织的分布趋势同NCT高度一致。不同的是，在神经元内PS1免疫阳性物在胞质表达较强，而NCT免疫阳性物在胞浆、胞膜均有强表达。

3 神经型尼古丁受体在AD中的作用及与γ-分泌酶的关系

神经型尼古丁受体(nAChR)与很多大脑功能有关，在AD的发病中占有重要的作用。通过对AD患者的正电子发射图谱(PET)研究发现，在疾病发生的早期即出现特异性的尼古丁受体减少，这与AD患者认知功能关系的改变有着密切关系〔27〕。研究表明在AD患者的大脑皮层的nAChR的含量明显减少〔28〕。Guan等〔29〕研究也发现Aβ25-35和Aβ40均可抑制体外培养细胞中尼古丁受体基因的表达,还调节多种其他受体的功能，并具有对抗神经细胞毒素性神经保护作用〔30〕。已经证实患者脑组织多个区域中尼古丁受体水平降低〔26〕。受体结合实验发现AD患者大脑尼古丁受体密度降低，与大脑颞叶皮质SPs的增多程度呈负相关。

Paterson等〔31〕报道AD患者脑中高亲和力的尼古丁受体数目明显的下降，在以后的尸检和活检中也发现了尼古丁受体的明显降低。AD患者脑组织中nAChR水平明显降低，该受体在 AD的发生发展中起重要作用。研究表明α7 nAChR功能与大脑学习和记忆能力有关，并具有明显的神经保护作用〔32，33〕。

在研究中发现，AD病人尸解后脑组织中，海马和大脑皮层区域尼古丁受体a4亚单位蛋白质水平分别较同龄对照组降低了35%和47%；α3亚单位分别降低29%和35%；α7亚单位亦有明显降低；但β2亚单位与对照组相比无明显的差异。很多实验也得到相似结果〔34，35〕。我们的研究显示，经Aβ脑室注射的大鼠脑组织中，尼古丁受体α7亚单位较对照组明显降低，说明 Aβ1～42能够引起α7亚单位蛋白水平表达降低。

nAChR亚单位除了与大脑的学习和记忆功能有关外，还具有明显的神经保护作用〔27〕。大量研究表明，神经递质性受体与APP的代谢过程有密切联系，在AD的发病中起着重要的作用〔36〕。其中α7nAChR与AD的发生关系密切，具有明显的神经保护作用，但其神经保护作用机制并不清楚。在APPSWE转基因大鼠脑标本中可见α3nAChR的选择性升高，提示α3nAChR的升高是对Aβ毒性作用的一种保护机制。

4 结 论

目前的研究已经证实尼古丁受体与很多大脑功能有关，而AD发生时有上述功能的损害并有nAChR数量的减少和表达的低下，因此可以说在AD的发生和发展中nAChR起着重要的作用。在Aβ代谢过程中的关键酶即γ-分泌酶是Aβ代谢的关键酶，是其代谢的最后一步，也是产生不溶性片段的关键酶，而目前对Aβ的代谢水平研究上γ-分泌酶的研究比α和β分泌酶更有前景，所以γ-分泌酶的研究是为AD的治疗提供新的靶点。

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