绞股蓝皂甙对2型糖尿病并非酒精性脂肪性肝病大鼠肝细胞核因子-1α的影响

贺 琴 李德梅 谭华炳

(湖北医药学院附属人民医院，湖北 十堰 442000)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是2型糖尿病(T2DM)主要并发症之一，T2DM患者NAFLD检出率为50.45%〔1〕。NAFLD导致高脂血症、动脉粥样硬化、T2DM〔2～4〕。绞股蓝及绞股蓝皂甙(GPS)能够降低NAFLD兔肝脏脂质沉积量〔5〕，有治疗T2DM、代谢综合征(MS)作用〔6，7〕。本研究通过高脂饲料饲养联合链脲佐菌素(STZ)注射建立T2DM并NAFLD大鼠模型，观察GPS对T2DM并NAFLD大鼠肝细胞核因子(HNF)-1α的影响，探讨GPS是否是通过干预HNF-1α达到防治T2DM并NAFLD的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 65只SPF级雄性SD大鼠，体质量220～250 g，由湖北医药学院动物实验中心提供〔合格证号：No.scxk(湘)2009-0004〕。实验场地湖北省十堰市实验动物中心(湖北省实验动物设施使用证明号：00015644)。

1.2实验饲料 普通饲料由湖北医药学院动物实验中心提供。胆固醇购自北京双旋生物培养基制品厂。猪油由市售板油自行炼制而成，蛋黄粉由市售鸡蛋自行制作。高糖高脂饲料由湖北医药学院动物实验中心按实验配方配制成成品使用(配方：78%普通饲料+2.5%胆固醇+8%蛋黄+7%猪油+4.5%蔗糖)。高脂饲料由湖北医药学院动物实验中心按照实验设计配方配制成成品使用(配方：82.5%普通饲料+2.5%胆固醇+8%蛋黄+7%猪油)。

1.3实验模型建立

1.3.1实验动物的分组 SD大鼠购入后，普通饲料饲养观察1 w，动物无死亡及不良反应。按照实验设计将65只大鼠分为空白对照组(7只，N组)，NAFLD模型组(NM组，7只)，T2DM并NAFLD模型组(51只)。

1.3.2T2DM并NAFLD造模与干预 参照文献〔9〕，每鼠每天高糖高脂饲料20 g左右，分两次投入，喂养4周；大鼠隔夜空腹腹腔注射链尿佐菌素(STZ)40 mg/kg，48 h后尾静脉取血，血糖>11.1 mmol/L，纳入实验组，造模成功率为100%；继续给予高糖高脂饲料喂养至8 w，建立T2DM并NAFLD模型。期间大鼠死亡15只。将全部大鼠分为GPS大剂量组(9只，JH组)，给予GPS 1 g·kg-1·d-1灌胃；GPS小剂量组(9只，JL组)，给予GPS 0.5 g·kg-1·d-1灌胃；T2DM并NAFLD模型对照组(9只，M组)同等体积的纯净水灌胃；继续给予高糖高脂饲料，自由饮水；治疗周期为6 w；实验周期14 w。

1.3.3N组、NM组饲养与管理 N组每天给予普通饲料20 g左右(根据NAFLD组进食量调整)；MN组给予高脂饲料20 g左右(依据前一天进食量决定第二天进食量)；饲料分2次投入。自由饮水。实验周期14 w。

1.4肝脏病理学检测 在肝脏最大叶，取肝组织0.5 cm，常规规定、切片、HE染色，检测肝脏病理学变化。

1.5常规实验材料和设备 STZ购于美国Sigma公司。GPS购自安康东科麦迪森天然药业有限公司，纯度为98%。Olympus DP-70显微摄影系统(日本，奥林巴斯公司)。

1.6HNF-1α检测设备、试剂、方法

1.6.1检测设备、试剂 Heal Force离心机(台式高速冷冻离心机Neofuge 15R)。PCR仪(Hangzhou Bioer Teechnology Co.，LTD；Life express Thermal Cycler)。荧光定量PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司，SLAN荧光定量PCR检测系统)；超净工作台(苏净安泰公司，SW-CJ-1FD)。总RNA提取试剂Trizol Reagent(15596-026，Invitrogen Life Technologies生产)；离心管、TIP头均购自Axygen Biosciences公司。ReverTra Ace-α反转录(TOYOBO First Strand cDNA Synthesis Kit，FSK-100)。实时荧光定量PCR(TOYOBO THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix，QPS-201)。引物由Invitrogen Biotechnology Co.，LTD中国公司合成。

1.6.2检测方法 总RNA抽提(取匀浆器，加入1 ml的Trizol试剂，置冰上预冷；取100 mg组织，加入到匀浆器中；充分研磨直至无可见组织块；加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15 s，充分混匀，静置3 min；4℃离心8 min；将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀；-20℃放置15 min；4℃离心10 min，管底的白色沉淀即为RNA；吸除液体，加入75%乙醇1.5 ml洗涤沉淀；4℃离心5 min；将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3 min；加入20 μl无RNA酶的水溶解RNA。反转录:取一PCR管，加入含2 μg RNA的溶液；加入1 μl oligo(dT)15；用无核糖核酸酶的去离子水补足至12 μl；于PCR仪上70℃保温5 min，迅速置冰上冷却；依次加入4 μl 5倍缓冲液，2 μl 10 mmol/L dNTPs，1 μl RNA抑制剂和1 μl反转录酶，用枪抽吸混匀；于PCR仪上42℃保温30 min，结束后80℃保温5 min灭活反转录酶)。定量PCR(取0.2 ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管，2×qPCR Mix 12.5 μl，2.5 μmol/L基因引物 2.0 μl，反转录产物 2.0 μl，ddH2O 8.5 μl；取0.2 ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管，2×qPCR Mix 12.5 μl，2.5 μmol/L内标引物 2.0 μl，反转录产物 2.0 μl，ddH2O 8.5 μl。PCR扩增：预变性 95℃ 1 min，循环(40次) 95℃，15 s→58℃，20 s→72℃，20 s，末段延 72℃ 5 min，溶解曲线 72℃→95℃，每20 s升温1℃。

1.7统计学方法 采用SPSS9.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1实验过程中大鼠数量变化 同文献〔9，10〕，模型组在T2DM并NAFLD造模过程中，死亡大鼠15只，死亡率为29.41%；在干预过程中，JH、JL、M组分别有1、2、3只大鼠死亡，实验结束JH组实有大鼠8只，JL组实有大鼠7只，M组实有大鼠6只。NM组实验过程中死亡1只，实有大鼠6只。N组大鼠饲养过程中无死亡。实验开始有大鼠65只，实验结束实有大鼠34只。

2.2HNF-1α变化 以N组扩增倍数为1计算，MN组HNF-1α表达为0.85，与N组比较有显著差异(P<0.05)；M组为0.62，与N组比较有显著差异(P<0.01)；JH治疗组HNF-1α升至0.80，与M组比较有显著差异(P<0.01)；JL治疗组HNF-1α升至0.68，与M组比较有显著差异(P<0.05)。

2.3肝脏病理学 N组为正常肝脏，NM组为重度脂肪肝，M组脂肪肝程度最严重；JL组与NM组程度相似；JH组脂肪肝程度最轻。

3 讨 论

T2DM由于与NAFLD在发病机制上存在“共同土壤”胰岛素抵抗(IR)而成为其重要病因〔11〕。HNF-1α是调控许多肝功能基因表达的重要转录因子，对促进肝脏发育和维护肝细胞生物学功能发挥重要作用〔11〕。HNF-1α在肝脏内高水平表达，参与肝脏糖、脂代谢相关基因特异性表达的调控〔10〕。HNF-1α是否参与T2DM并NAFLD的发病，以及GPS是否是通过影响HNF-1α达到治疗目的，是本研究关注的问题。研究显示T2DM并NAFLD大鼠糖脂代谢能力下降，肝细胞其他生理学功能下降，加重糖尿病和NAFLD发展。GPS对T2DM并NAFLD大鼠HNF-1α定下降具有干预作用，从而改善糖脂代谢，打断恶性循环。至于GPS通过何途径抑制HNF-1α有待进一步研究。中医认为T2DM合并NAFLD是由于湿热内蕴、痰瘀互结。现代药理研究证明绞股蓝含有83种与人参皂甙有类似骨架的达玛烷型绞股蓝皂甙，皂甙具有抗炎、降低血脂、降血糖和免疫调节等多方面的生物活性和药理作用〔11〕，Norberg等〔12〕从绞股蓝中分离提纯出一种新的皂甙，存在4种可以相互转化的立体异构体，在体外及动物实验中均发现，其可刺激胰岛细胞释放胰岛素，且呈现剂量依赖性。Xu等〔13〕发现其可以通过抑制蛋白酪氨酸磷脂酶来控制胰岛素的敏感度。本研究提示，GPS具有多靶点干预T2DM并NAFLD作用，在防治T2DM并NAFLD方面具有一定的优势。本研究提示，GPS通过调整肝组织HNF-1α表达，对T2DM并NAFLD具有治疗作用，结合既往研究说明GPS多靶点治疗T2DM并NAFLD。

4 参考文献

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3谭华炳，李金科，胡 波,等.非酒精性脂肪性肝病兔胰岛素水平变化及其机理探讨〔J〕.西南国防医药杂志，2010；20(9)：937-9.

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12Stoffel M，Duncan SA.The maturity-onset diabetes of the young (MODY1) transcription factor HNF 4α regulates expression of genes required for glucose transport and metabolism〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1997；94(24)：13209-14.

13张 娟，路金才.皂甙的提取方法及含量测定研究进展〔J〕.中国现代中药杂志，2006；8(3)：25-8.

14Norberg A，Hoa NK，Liepinsh E,etal.A novel insulin-releasing substance，phanoside，from the plant Gynostemma pentaphyllum〔J〕.J Biol Chem，2004；279(40):41361-7.

15Xu JQ，Shen Q，Li J,etal.Dammaranes from Gynostemma pentaphyllum and synthesis of their derivatives as inhibitors of protein tyrosine phosphatase1B〔J〕.Bioorg Med Chem，2010；18(11)：3934-9.