趋化因子CXCL5在胃癌组织中的表达

姜大力 贾秀月 王伟群

(佳木斯大学附属第二医院泌尿外科，黑龙江 佳木斯 154002)

趋化因子生长调节基因(CXCL5)5是促血管生成性趋化因子家族中的一员，可由多种细胞产生，具有很强的粒细胞趋化作用。CXCL5与受体CXCR2结合行使生物学效应。CXCL5可促进非小细胞肺癌、胃癌及子宫内膜癌等肿瘤的发生、发展和转移。本研究拟探讨CXCL5在胃癌中的表达及意义，有望为胃癌的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1对象 收集佳木斯市各医院2012年1～5月经临床确诊的胃癌标本36例，切取胃标本中新鲜癌组织(去除坏死组织)和正常黏膜组织(距癌组织10 cm以外，病理学证实无癌浸润)各两份，一份标本切下后立刻投入液氮罐中，然后转入-80℃冰箱内保存，用于提取RNA，行实时荧光定量PCR技术检测。另一份标本4%甲醛固定，石蜡包埋，进行常规病理检查和免疫组织化学检测。男23例，女13例，平均年龄59岁。高中分化18例，低分化18例。TNM分期，Ⅰ/Ⅱ期13例，Ⅲ/Ⅳ期23例。有淋巴结转移28例，无淋巴结转移8例。所有患者术前均未接受化疗和放疗，经术后病理学证实诊断。

1.2主要试剂 RNA提取试剂Trizol、RNA酶抑制剂、dNTPs等荧光定量PCR试剂、兔抗人趋化因子配体5抗体购自TaKaRa公司，SP免疫组化试剂盒及DAB染色试剂盒购自武汉博士德公司。操作步骤按试剂盒说明进行。

1.3免疫组化方法 采用SP法。2 μm厚石蜡切片脱蜡水化。经高压抗原修复，依次加入一抗及二抗后，DAB底物显色。苏木素染核，中性树胶封固。每张切片随机观察5个200倍视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞数平均百分比进行计分，再根据染色的强弱进行计分。二者的计分相加。

1.4实时荧光定量PCR方法 引物利用Primer Premier 5.0设计，根据GenBank查找mRNA序列，由TaKaRa公司合成。跨内含子序列，以保证扩增的特异性。CXCL5引物为：正义5′-GACGGTGGAAACAAGGAAAA-3′；反义5′-GCTTAAGCGGCAAA-CATAGG-3′。GAPDH引物为：正义5′-CGACCACTTTGTCAAG-CTCA-3′；反义5′-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3′。

按试剂盒说明Trizol提取总RNA。取总RNA1 μg在PCR仪中进行逆转录反应合成cDNA：oligo(dt)primer 1 μl，DEPC H2O补齐至12 μl，70℃孵育5 min，置冰上，加入逆转录缓冲液1 μl，10 mmol/L dNTP mix 2 μl，37℃孵育5 min，置冰上，逆转录酶1 μl，42℃60 min，70℃热灭活10 min，分装置-20℃冰箱内保存。25 μl PCR反应体系：模板2 μl，10×PCR 缓冲液2.5 μl，2 mmol/L dNTP mix 1 μl，上下游引物各1 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，Takara Taq DNA聚合酶0.25 μl，ddH2O 15.75 μl。94℃预变性3 min，然后94℃45 s，58℃45 s，72℃45 s，30次循环，然后72℃7 min，最后至4℃终止。制备1.5%及2%琼脂糖凝胶电泳，取PCR产物18 μl加入6×上样缓冲液3 μl上样，另取DNA marker 5 μl，在0.5×TBE电泳缓冲液中以120 V电压电泳30 min后，紫外灯光下观察结果。摄像仪将含有产物条带的电泳图像扫入电脑，通过凝胶图像处理系统分析目的基因条带。进行PCR产物的检测和分析。

1.5统计学分析 应用SPSS13.0 软件行χ2检验。

2 结 果

2.1实时荧光定量PCR结果 CXCL5在胃癌组织中的表达量为10.02±3.91，明显高于在胃正常上皮组织的表达量(1.76±0.48)(P<0.000 1)。

2.2免疫组化分析结果 CXCL5蛋白阳性表达主要位于细胞质，呈黄色或棕色颗粒；胃正常组织中大部分细胞呈阴性表达。36例癌旁胃正常组织中，CXCL5蛋白阳性表达12例(33.33%)；36例胃癌组织中CXCL5蛋白阳性表达26例(72.22%)。两组间CXCL5蛋白表达率比较差异显著(χ2=10.92，P=0.000 9)。

3 讨 论

CXC趋化因子是一组和肿瘤血管生成关系密切的因子，也是肿瘤的发生、发展、侵袭及转移的重要调节因子之一。CXCL5与其受体CXCR2结合并介导其趋化作用及血管新生的促进作用。在肿瘤发生发展的过程中，微环境中的血管扮演着重要的角色，其不但促进肿瘤的增殖和侵袭，而且还参与肿瘤的转移〔1〕。Li等〔2〕研究表明，胰腺癌中 CXCL5 可以激活Akt和STAT 等信号通路最终介导肿瘤组织血管的生成。另外，肿瘤细胞可以自分泌和旁分泌CXCL5 从而促进其自身的存活和增殖。在A549细胞株和鳞状上皮细胞癌细胞株Calu 1中显示CXCL5是促血管生长因子〔3〕。Park等〔4〕研究证实，CXCL5的高表达与晚期胃癌及淋巴转移密切相关。这些表明，CXCL5 参与了肿瘤的侵袭及转移过程。

本实验结果充分说明CXCL5在胃癌发生、发展中的重要作用。这可能由于 CXCL5与受体CXCR2结合后作用于酪氨酸激酶受体，从而引起血管内皮细胞增殖、趋化运动及抑制内皮细胞凋亡等一系列促进肿瘤血管新生的生物学效应〔5〕。 此外，CXCL5与特异性受体CXCR2结合后还可通过MAPK和PI3K信号通路，活化转录因子ELK1，从而激活一系列与肿瘤形成相关的基因表达〔6〕。CXCL5的过表达能提高胃癌细胞侵袭和转移能力，并可诱导内皮细胞产生与肿瘤转移密切相关的基质金属蛋白酶9(MMP-9)，促进肿瘤的转移〔7〕。

4 参考文献

1王伟群，李 扬，李润生.前列腺癌的间质微环境变化〔J〕.生殖与避孕，2008；28(6):367-70.

2Li A，King J，Moro A，etal.Over expression of CXCL5 is associated with poor survival in patients with pancreatic cancer〔J〕.Am J Pathol，2011；178(3):1340-9.

3Arenberg D，Keane M，DiGiovine B，etal.Epithelial-neutrophil activating peptide (ENA-78) is an important angiogenic factor in non-small cell lung cancer〔J〕.J Clin Invest，1998；102(3):465-72.

4Park JY，Park KH，Bang S，etal.CXCL5 overexpression is associated with late stage gastric cancer〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2007；133(11):835-40.

5Manna SK，Ramesh GT.Interleukin-8 induces nuclear transcription factor-kappaB through a TRAF6-dependent pathway〔J〕.Biol Chem，2005;280(8):7010-21.

6Maxwell PJ，Gallagher R，Seaton A，etal.HIF-1 and NF-kB-mediated upregulation of CXCR1 and CXCR2 expression promotes cell survival in hypoxic prostate cancer cells〔J〕.Oncogene，2007;26:7333-45.

7Jin Kim Sun，Hisanori Uehara.Expression of interleukin-8 correlates with angiogenesis，tumorigenicity，and metastasis of human prostate cancer cells implanted orthotopically in nude mice〔J〕.Neoplasia,2001;3(1):33-42.