分子生物学技术在中医证候研究中的应用探讨

牛晓红

(中国中医科学院医学实验中心，北京 100700)

分子生物学是从分子水平去探讨人类生命规律的一门学科。近年来，基因工程制药、基因治疗法等分子生物学技术的广泛应用，在各个领域均取得了理想的效果。但在中医临床和基础研究中，如何科学地将分子生物技术运用到中医证候、中药作用机制等相关研究中，发挥中医药的优势已成为中医药工作者不断思考和探索的关键问题。随着人们对于中医药的重视，许多研究人员运用现代化的新观念和新技术开始对中医药进行研究，并已成功地将分子生物技术运用于中医证候研究中，这将有利于从分子水平去研究中医理论、疾病的发生发展规律以及有针对性地研制中药，更好地发挥中医辨证施治的临床作用，从而更好地为人类健康服务。

1 中医证候与分子生物学理论层次高度关联

中医是我国医学界的重要分支，治疗过程中主要以辨证施治和加减药物治疗为主，在临床上取得了理想的效果，这也成为中医赖以生存和发展的基础，这两个基础均依赖于中医证候。从中医角度来说，“阴阳失调，百病丛生”，许多疾病的发生均由阴阳失调所致，察阴阳而调之也成为中医临床诊断、治疗的基本原则和基本方法。中医认为肾是人的根本，它决定了人的生长、发育、体质、疾病等，但是其先天因素又同样受到后天因素的影响和调节。从现代分子生物学角度来说，一个人基因是其生存和发育的主要因素，它决定人的生老病死，但是基因又不是全部，它同样受到人类的生活、环境、习惯等影响。综上所述，两者在概念上存在着许多相似之处，这也为从分子水平对疾病的本质进行深入探讨指明了新的发展方向。而从分子角度对疾病进行研究分析，能填补中医证候微观还原分析的一些空白之处，因此医学界利用分子生物学理论和技术研究中医证候便显得至关重要。

2 分子生物学技术发展使中医证候实质研究成为可能

从中医角度来说“有诸于内必形诸于外”，这句话的意思就是当人内在功能等发生紊乱时，必然在人的外表中体现出来，通过外部彰显内在的联系，这样就能够通过外在去寻找内在的证候，从基因的多态性演变为分子的联系性。自分子生物学技术诞生后，可以通过分子生物学技术手段对人体的一些疾病证候、健康状态等进行研究，发现人当前状态和基因表达谱上存在的差异，从而说明不同证候状态下分子生物学层次的差异。换言之，应用分子生物学技术研究同一疾病的不同证候和同一证候不同的疾病，以及同一个体不同状态等之间的基因差异，能够找出其共同点和不同点，针对基因突变和异常表达与疾病的关系进行分析，为中医证候研究提供分子生物学基础，同时为中医异病同治、同病异治等理论提供有力的依据。另外，随着分子生物学技术的飞速发展，利用分子生物学技术能够研究细胞内基因表达，而基因表达是通过DNA控制蛋白质的合成来表现的。因此，分子生物学对于蛋白质研究在技术上的突破将为证候与蛋白质的结合研究奠定基础。在这一方面，有关蛋白质芯片的深入研究、纳米技术的使用，将为蛋白质的研究、中医证候的研究提供发展的契机[1]。

3 中医证候特征与基因多态性研究

中医证候是机体在疾病发展过程中的某一阶段的病理概括，众多学者认为中医证候与现代医学疾病必然有其内在的本质联系,尤其体现在基因组学领域。利用分子杂交、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)、分子克隆、基因工程等分子生物学技术使基因诊断和基因治疗得以实现，而芯片技术的出现又使它们在快速、准确等方面得以提高。随着分子生物学技术的发展及对中医证本质认识的深入,中医证候研究已经从症状、体征为主体发展到目前的分子基因水平。

中医证候具有整体性、时空性、传变性和个体差异4个特征。许多基因具有的多态性变化与某些疾病的发生有密切相关性，而某一病症的不同中医证候发生频率在一定范围内的分布则是相对稳定的，中医临床证候的多样性和复杂体系正好是基因多态性与临床表型多样性关系的最好研究对象[2]。近年来，在证候的基因多态性研究中也取得了一些成果。如唐发清等[3]报道了高血压病肝阳上亢证与酪氨酸羟化酶(TH)基因扩增有关。欧阳涛等[4]研究发现，ApoE第一内含子增强子BxpL1位点的G/G基因型可能是冠心病及冠心病痰证及痰瘀互阻证的易感基因之一。陈卫衡等[5]通过ApoAI、B基因多态性与非创伤性股骨头坏死证候相关性研究发现，ApoAI基因启动子-75bp位点多态性、启动子-内含子位点多态性及ApoB基因XbaI基因型，与非创伤性股骨头坏死证候分型有一定相关性。谢毅强等[6]通过2型糖尿病大血管病变患者脂代谢紊乱与ApoE基因多态性及中医证候的研究发现，2型糖尿病大血管病变患者的血脂随着病情的加重和病程的延长存在不同程度的异常,各种中医证候之间脂代谢的差异与ApoE基因的多态性有一定关系。这些研究结果提示，疾病有关基因多态性与中医证候多样性及发生频率的规律性间可能存在某种关联。

4 中医临床与分子生物学

临床上利用分子生物学技术对相关疾病基因进行干预和分析，从而有效地探讨中药作用的分子机理与作用靶点。吴志奎等[7]研究显示，补肾生血药(方药组成：山茱萸、熟地黄、龟板胶、阿胶等药物组成)能有效提高贫血患者体内的血红蛋白和抗碱血红蛋白，提高血红蛋白的珠蛋白链比值，其作用机理可能是补肾生血药能提高珠蛋白链γ/β+γ比值,促进γ-珠蛋白基因的转录和表达,诱导HbF合成,从而代偿β-珠蛋白基因功能的缺陷。谢金锦等[8]研究了补阳还五汤对球囊扩张主动脉后再狭窄其内皮血小板衍化生长因子的影响，实验结果显示，补阳还五汤能够增加人体动脉内皮SOD-1基因表达，有效地改善血灌注供氧能力，同时这种中药还能够有效地抑制血小板衍化生长因子受体的mRNA表达，从而控制细胞等病理性繁衍、增殖等。从分子生物学角度可以看出，补阳还五汤能够有效地调节人体平衡，而并不是简单的单因子作用。张国强等[9]利用分子生物学技术对丹参治疗狼疮性肾炎效果及其影响等进行了研究，实验结果显示，丹参能够有效地抑制人体肾脏纤维等相关细胞的增殖，并能够提高C-myc蛋白高水平而诱导细胞死亡。因此，临床在治疗狼疮性肾炎及肝硬化等疾病时丹参能够发挥重要作用。

5 中药与分子生物学

分子生物学技术自创立以来在医学中广泛使用，在中药相关领域中的应用也越来越受到重视。

5.1 分子生物学技术在中药作用机理研究中的应用

中药是临床上使用较多的一线药物，患者用药后药物能够直达病灶，有效地缓解病情。但医学界对于中药的作用机理并不完全知晓，随着分子生物学技术在中药研究中的不断应用，能够有效地探讨中药的作用机理。患者服用中药后，中药的作用环节和生命分子之间存在或多或少的联系，当中药发挥作用时必然会引起遗传信息的改变，而决定其改变基础的则是基因。根据近年来的相关研究结果初步显示，中药的作用与其生物活性成分调控基因的表达有关。我国科研人员曾对人参、黄芪、淫羊藿、灵芝等药物在人体细胞因子中调控人体免疫功能等进行实验[10]。曹颖英等[11]在研究淫羊藿甙促进小鼠脾细胞IL-3mRNA及IL-6mRNA的表达中发现,患者服用中药后，药物能够有效地诱导淋巴细胞IL-3mRNA、IL-6mRNA等遗传基因的表达，且药物的促进作用与患者药物剂量关系密切。陈记藩等[12]进行了1项实验，实验中采用分子生物学技术研究通痹灵，结果显示，中药能够降低患者体内mRNA水平，通痹灵在治疗过程中能够有效地抑制滑膜细胞内异常升高的TNF-αmRNA表达，降低TNF-αmRNA水平。唐咸玉等[13]用半定量逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)方法测定各组大鼠心肌N-rasmRNA的含量，发现ras癌基因在心肌肥厚形成发展过程中起到一定作用， 中医活血祛痰治法可逆转心肌肥厚， 其治疗机理可能是抑制了心肌ras原癌基因的高表达。

近年来采用基因芯片技术对中药复方进行了研究,以往采用传统研究方法仅限于中药复方某一方面或几方面的作用研究,很难对该复方有全面的认识,尤其是对新功能的认识和开发。而应用基因芯片技术能够迅速了解该复方对基因组中某些基因表达的影响,从而不仅了解该复方的原有功能,还有可能很轻易地发现该复方组方后可能出现的新功能,为复方的新功能开发提供客观依据。

5.2 分子生物学技术与中药资源

近年来，随着我国医疗技术的飞速发展，分子生物学技术在中药资源等方面也做出了杰出的贡献。当前，我国很多野生中药资源都濒临灭绝，且很多人工栽培的中药品质不高，使得临床使用中成药存在很大困难。因此临床上采用药用植物转基因等技术能够对相关植株进行良种繁殖，有效地提高药材质量，并能够获得化合物能力更强的突变植株。胡之璧等[14]应用植物细胞培养技术进行洋地黄培细胞的生物转化研究，筛选出高产细胞并获得了相当好的遗传稳定性。另外已培养出抗癌活性成分三尖杉酯含量高于原植物的三尖杉培养细胞[15]。研究发现栝楼中的天花粉蛋白强烈抑制HIV病毒和很多其他病毒，具有显著的临床效果，其需求量日益增大，现在其编码基因已被克隆，并在大肠杆菌中高效表达。分子生物学技术的发展使利用转基因动物获得像麝香、牛黄、犀牛角等一些动物性中药成为可能，从而大大节省了资源，保护了这些濒危的动物。

5.3 分子生物基因芯片技术在中药筛选和新药研发中的应用

随着医疗技术的飞速发展，我国基因研究也进入到后基因时代，在后基因时代的中药、证候研究中，随着基因结构和功能研究的突破，致病基因的发现，药物的研究目标之一是在基因水平上寻找药物靶标，通过比较药物处理前后细胞基因表达的差异来推测筛选药物作用的靶标，从而找到“导向药物”。目标之二是用基因芯片技术检测药物的毒性或副作用，进行毒理研究。而生物芯片技术所具有的高集成与组合化学相结合，为新药研究的初筛提供超高通量筛选。

Clarke等[16]采用基因芯片研究了肠癌患者化疗前和治疗期间肿瘤基因表达情况,发现丝裂霉素C和5-氟尿嘧啶治疗均可使糖苷合成酶和尿嘧啶-DNA糖基酶的基因表达增加。该研究提示,这类研究既有助于阐明药物的作用机制,也有助于确定药物作用的靶基因,筛选出有效中药及其有效成分，为新药研究提供线索。随着芯片技术的不断发展以及在药物开发、靶标寻找等方面的广泛应用，将有利于确定中药的有效活性成分和有效活性部位，为开发中药新药提供一个简便、快捷的新途径。

6 结语

综上所述，中医证候实质的揭示已成为制约中医药现代化研究和发展的瓶颈之一。然而，中医证候特征与基因多态性理论在理论层面给予了我们许多具有探索价值的启示，特别是分子生物学技术的发展，使我们从分子生物学角度解释中医证候实质成为可能，许多学者的探索也取得了阶段性进展。但相关研究仍处于初级阶段，临床上对于中医证候的认识还不十分完全，因此中医证候及中药作用机制等方面的研究尚需我们进一步的探讨和完善。

[1] 赵燕平，赵燕琴.分子生物学在中医药学中的应用情况及前景探讨[J].浙江中西医结合杂志，2001，11(9):529-531.

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[3] 唐发清，金益强,鄢东红，等.高血压病肝阳上亢证络氨酸羟化酶基因多态性分析[J].湖南中医学院学报，2000，20(2)：3-4.

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[5] 陈卫衡,张书钦，林娜，等. ApoAI、B基因多态性与非创伤性股骨头坏死证候相关性研究[J]. 中国中医骨伤科杂志,2010(7):1-4.

[6] 谢毅强，王华，吴月平，等. 2型糖尿病大血管病变患者脂代谢紊乱与ApoE 基因多态性及中医证候的研究[J]. 中华中医药杂志，2011，26(1)：144-146.

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[9] 张国强，叶任高，孔庆瑜，等.丹参对狼疮性肾炎成纤维细胞增殖、凋亡及C-myc蛋白表达的影响[J].中国中西医杂志，1997，17(8):473.

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[13] 唐咸玉，王剑，严灿，等.活血祛痰法对高血压左心室肥厚大鼠心肌ras原癌基因表达的影响[J].中医研究，2001，14(1)：14-16.

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[16] Clarke PA George M,Cunningham D, et al. Analysis of tumor gene expression following chemotherapeutics of patients with bowel cancer [J/OL], Nat Am Inc. http://llgenetics. nature. com,1999.