重组人睫神经营养因子（rhCNTF）对营养性肥胖大鼠减肥作用的实验研究

张书文

（辽宁省阜新市卫生学校，辽宁 阜新 123000）

重组人睫神经营养因子（rhCNTF）对营养性肥胖大鼠减肥作用的实验研究

张书文

（辽宁省阜新市卫生学校，辽宁 阜新 123000）

胖在21世纪已作为一种疾病被人们普遍关注，从而使减肥药物的研究受到了前所未有的重视。重组人睫神经营养因子（recombinant human ciliary neurotrophic factor，rhCNTF）是第一个运用生物工程技术研发的蛋白多肽类减肥药物。

睫神经营养因子；减肥作用；Lee's指数；脂肪系数；绒毛密度

肥胖在21世纪已作为一种疾病被人们普遍关注，从而使减肥药物的研究受到了前所未有的重视。重组人睫神经营养因子（recombinant human ciliary neurotrophic factor，rhCNTF）是第一个运用生物工程技术研发的蛋白多肽类减肥药物。美国Regeneron公司开发的rhCNTF商品名称为Axokine已于2001年获FDA批准在美国进入Ⅲ期临床试验。

睫神经营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）是一种由200个氨基酸组成的相对分子质量为23000的生理活性物质。CNTF最初曾用于治疗肌侧索硬化症（ALS，一种神经系统疾病）[1-4]，但临床试验中发现CNTF对ALS疗效不明显，却意外发现患者的体质量显著降低，从而引起人们的关注，力图将其开发成为一种新型的减肥药物。本实验根据卫生部1993年颁布的新药开发指导原则，旨在通过动物实验来查明rhCNTF的减肥作用及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

①药物：a.供试药物：rhCNTF粉针剂，规格：2毫克/支，纯度：98.6%，临用前以灭菌注射用水2 mL溶解，并用生理盐水稀释至所需浓度。b.阳性对照药：盐酸西布曲明粉剂，纯度：99.7%，临用前以0.5%CMC配制成浓度为0.16%的混悬液。②受试动物：刚断乳的SD大鼠，体质量为（77.28±6.91）g。

1.2 方法

①肥胖大鼠模型的建立：取刚断乳SD大鼠60只，雌雄兼用，随机分成2组：第1组为正常对照组，20只大鼠，雌雄各半，投以普通饲料；第2组为造模组，100只大鼠，雌雄各半，投以营养饲料。各鼠分笼饲养，两组大鼠每天每只投以等量饲料，第1、2周内每天每只大鼠13 g，以后每周增加2 g。造模组动物平均体质量超过正常对照组平均体质量50%定为肥胖模型建立。②分组与给药：肥胖模型建立后，先将大鼠随机分成A、B两大组，雌雄各半，A组为短期（10 d）给药组，B组为长期（33 d）给药组。A、B组各包括正常动物10只，肥胖动物50只，将A、B两组动物再分别分成6组，每组10只，雌雄各半，分别为：a.正常对照组：自颈背部sc稀释液1.0 mL/（kg·d）（正常大鼠）；b.肥胖对照组：自颈背部sc稀释液1.0 mL/（kg·d）（肥胖大鼠）；c.高、中、低剂量组：自颈背部分别给sc rhCNTF 300 μg/（kg·d）（300 μg/mL ×1 mL/（kg·d））（肥胖大鼠）、sc rhCNTF100 μg/（kg·d）、100 μg/mL ×1 mL/（kg·d）、30 μg/（kg·d）、30 μg/mL×1 mL/（kg·d）；d.阳性药对照组：灌胃（ig）盐酸西布曲明8 mg/（kg·d）、1.6 mg/mL×5 mL/（kg·d）（肥胖大鼠）。③实验测定指标：肥胖大鼠模型建立期间，每天早10：00称取动物剩余食物量、投食量及撒食量，以计算动物摄食量。每周末早9：00称取动物体质量1次，与正常对照组比较，以监测肥胖模型组体质量的增重情况。动物饲养条件为温度：（21±1） ℃，相对湿度为45%～55%。肥胖模型建立后，分组给药，每天早9：00称取动物体质量，然后按体质量给药。每天早10：00称取动物的剩余食物量、投食量及撒食量以计算摄食量。末次给药后12 h，动物禁食过夜，次日用12%的水合氯醛2.5 mL/kg腹腔麻醉，测其体长（从鼻尖到肛门的长度），体质量，按公式计算Lee's指数；腹主动脉取血、离心3000 r/min×10 min得血清，然后按试剂盒说明测定血糖（Glu）及血脂[包括总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）]含量。取肾周、腹股沟周围及腹腔脂肪，称取湿重；取生殖器周围同一部位脂肪组织一小块，经2.5%的甲醛乙醇溶液固定后，包埋、石蜡切片、染色，在400倍显微镜下计数全视野脂肪细胞个数，并用测微器测量脂肪细胞大小；取一小段空肠，置于2.5%戊二醛中固定，并制成标本，用电镜扫描观察空肠绒毛长短粗细，比较各组间空肠绒毛密度和相对吸收面积。

1.3 统计学分析

采用SPSS10.0软件中的方差分析

2 结 果

2.1 营养性肥胖模型的建立

造模组大鼠给予营养饲料后体质量增速明显超过正常对照组，到第6周为止，正常对照组体质量增加106 g（137.7%），而造模组体质量增加205 g（267.7%）。造模组体质量为正常对照组的154%。两组间比较差异显著（P＜0.01），说明肥胖模型建立。

2.2 rhCNTF对营养性肥胖大鼠的减肥作用

①应用rhCNTF对肥胖大鼠体质量的影响：rhCNTF的减肥作用十分迅速，皮下注射第1天即出现体质量明显下降，说明给药后24 h即起效，每日给药后高、中剂量组持续出现负增长，到第8天作用最为明显，以后体质量负增长逐渐减少。②rhCNTF对营养性肥胖大鼠Lee's指数和脂肪系数的影响：肥胖对照组脂肪系数（3.63±0.96）及Lee's指数（298.33±5.82）与正常对照组（1.75±1.20和284.29± 8.94）比较均明显增加（P＜0.01）。与肥胖对照组比较，高、中剂量组的Lee's指数和脂肪系数明显降低（P＜0.01），低剂量组对这两项指标则无明显影响（P＞0.05）。阳性对照药（盐酸西布曲明）对肥胖大鼠的Lee's指数未显示出明显影响（P＞0.05）。③rhCNTF对营养性肥胖大鼠血脂、血糖的影响：肥胖大鼠较正常大鼠TC、TG及血糖水平明显升高，HDL-C明显降低。与肥胖对照组比较，高、中剂量组可使TG、TC及血糖下降至正常或接近正常水平，并都有升高HDL-C的作用。但低剂量组未显示出此种降低TC、TG、血糖及升高HDL-C的作用。阳性对照药有降低TC、TG和血糖作用，但对HDL-C未显示升高作用。

2.3 rhCNTF对营养性肥胖大鼠脂肪细胞大小的影响

400倍光镜下每视野的脂肪细胞数目在肥胖对照组明显少于正常组对照；在高、中剂量组分别为（43.00±9.38）/视野和（43.30± 8.04）/视野，与肥胖对照组（30.90±4.07/视野）比较明显增加（P＜0.01），亦即表明高、中剂量的rhCNTF能够使脂肪细胞减小。而低剂量几乎没有这种作用（P＞0.05）。阳性对照药西布曲明在短期应用中对脂肪细胞的大小也显示出明显影响。

2.4 rhCNTF对营养性肥胖大鼠空肠绒毛密度和相对吸收面积的影响

肥胖对照组空肠绒毛的密度及相对吸收面积均显著大于正常对照组（P＜0.01）。短期皮下注射rhCNTF后，营养性肥胖大鼠空肠绒毛密度及相对吸收面积与肥胖对照组比较未发生明显改变（P＞0.05）。这说明在短期内，rhCNTF对营养性肥胖大鼠空肠绒毛密度和相对吸收面积没有发生显著影响。

3 讨 论

3.1 本研究表明rhCNTF具有强大的减肥作用。表现为体质量、Lee's指数、脂肪系数以及TC和TG含量降低，HDL-C升高、脂肪细胞变小。以上各项指标的变化呈明显的量效关系。中剂量100 μg/（kg·d）和高剂量300 μg/（kg·d）给药后与肥胖对照组比较，上述指标均显示明显差异（P＜0.05或P＜0.01）。低剂量组30 μg/（kg·d）给药后体质量及其他有关指标与肥胖对照组比较均无明显差异（P＞0.05）。

3.2 该研究中剂量的选择主要依据参考文献[5～7]，并通过预试验确定。文献[6]报道大鼠ip CNTF 250 μg/（kg·d）×4 d产生了了显著的减肥作用。文献[5]报道ob/ob小鼠饲喂营养饮食诱发肥胖后，皮下注射CNTF 0.03、0.1及0.3 mg/（kg·d）×7 d，产生了明显的剂量依赖性减肥作用。文献7报道ob/ob小鼠ip rhCNTF（2～50 μg/鼠/d×25 d）[7]，产生了进行性剂量依赖性体质量下降，以及进食量的快速减少。我们在预试验中发现，大鼠皮下注射受试rhCNTF 30、100及300 μg/（kg·d）后数天即产生了剂量依赖性减肥作用。

3.3 本研究发现sc rhCNTF后，大鼠的进食量迅即进行性减少，至d4，进食量降至最低值，然后又逐渐回升，至d13基本达到给药前进食量水平，并维持这一稳定水平直至实验结束。而大鼠体质量的下降在第8天达到最低值，由此看出大鼠体质量的降低迟后于进食量的时程变化。大鼠ig阳性对照药西布曲明亦使进食量减少，与文献报道一致[7-9]。

3.4 本研究中rhCNTF使进食量降低似乎证明该药的减肥作用与其抑制食欲有关，这与国外文献报道一致[5，6，10]。

3.5 本研究发现在长期应用rhCNTF后，大鼠的空肠绒毛的相对吸收面积变小，这将影响营养物质在肠道的吸收，这可能是长期应用rhCNTF后大鼠进食量虽然已经恢复但依然表现为减肥效果的主要原因。

4 结 论

①受试rhCNTF对营养性肥胖大鼠具有明确的减肥作用，表现为体质量、Lee's指数、脂肪系数、血脂降低、脂肪细胞变小，空肠绒毛密度变小。其减肥作用呈明显的剂量依赖关系。②受试rhCNTF的减肥作用强，起效迅速。③受试rhCNTF具有减肥降脂作用，表现为TC、TG含量降低，而HDL-C含量升高。④受试rhCNTF减肥的同时具有明显的降糖作用。⑤受试rhCNTF的减肥作用可能与抑制食欲有关而长期应用rhCNTF表现的减肥作用很可能与该药降低绒毛密度从而影响营养物质自小肠的吸收有关。

[1] Jeffrey T,Henderson,Nadine A.Seniuk.Systemic administration of ciliary neurotrophic factor induces cacheia in rodents[J].J.Clin. Invest,1994,93(6):2632-2638.

[2] 汤立达.治疗肥胖药物的进展[J].世界科技研究与发展,2001,21 (5):71-73.

[3] 中华人民共和国卫生部药政局.新药(西药)临床前研究指导原则汇编(药学、药理学、毒理学)[C].1993:193-194.

[4] 中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范[S].2003.

[5] Larmbert PD,Anderson KD,Sleeman MW,et al.Ciliary neurotrophic factor activiates leptin—like pathways and reduces body fat,without cachexia or rebound weight gain,even in leptin-resestant obesity[J]. PNAS,2001,989(8):4652-4657.

[6] Xu B,Dube MG,Kalra SP.Anorectic effeets of the cytokine,ciliary neurotropic factor,are mediated by hypothalamic neuropeptide Y: comparison with leptin[J].Endocrinology,1998,139(20):466-473.

[7] Brown M,Bing C,King P,et al.Sibutramine reduces feeding,body fat and improves insulin resistance in dietary-obese male wistar rats independently of hypothalamic neuropeptide Y[J].Br J Pharmacol, 2001,132(10):1898-1904.

[8] 谭正怀,莫正纪,陈民.西布曲明对谷氨酸钠诱导的肥胖动物模型的影响[J].中国药理学通报,2001,17(6):675-678.

[9] 陈炎亮,李莉,严尚学,等.盐酸西布曲明对营养性肥胖大鼠的减肥作用[J].中国临床药理学与治疗学,2003,8(1):55-59.

[10] Gloagnen I,Costa P,Denartis A.Ciliary neurotrophic factor corrects obesity and diabetes associated with leptin deficiency and resistance[J].PNAS,1997,94(15):6456-6461.

R589.1

B

1671-8194（2014）27-0067-02