顺铂对人胃癌SGC7901细胞株中干细胞的影响

许 浪 (武汉科技大学医学院，湖北 武汉 430061)

肿瘤组织中存在极少量具有无限自我更新能力和多向增殖潜能的细胞，即肿瘤干细胞(CSC)，它们不仅在肿瘤的形成、发展和转移方面起着重要的作用，也可能是肿瘤耐药及抵抗放化疗的根源〔1，2〕。Nanog基因作为全能性或多能性干细胞标记物，在胚胎干细胞和包括肺癌、胃癌在内的多种 CSC中表达〔3，4〕。本研究旨在揭示顺铂干预人胃癌SGC7901细胞后，对胃癌干细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌细胞株SGC7901由武汉大学生命科学院惠赠。小鼠抗人Nanog多克隆抗体(Cell signaling公司)，SP-9000免疫组化试剂盒及DBA显色试剂盒(北京中山金桥生物技术有限公司);胎牛血清(杭州四季青公司);DMEM培养基、胰酶(Gibco公司)，Transwell小室(Corning公司)。

1.2 细胞培养 人胃癌SGC7901细胞接种于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，该培养基不含抗生素，5%CO2，37℃的细胞培养箱中常规传代培养。

1.3 体外顺铂干预 将细胞接种于96孔板，分为实验组和对照组。实验组第2天加顺铂，先通过MTT计算出加入顺铂作用72 h的IC50(7.22 μg/ml)，接种6孔板，第2天加入顺铂至终浓度5 μg/ml(低于IC50浓度)，72 h后收取细胞做后续实验。无药物干预作为对照组。

1.4 Hoechst33342染色法 检测顺铂对SGC7901细胞中SP细胞的比例的影响。药物干预完成后，倒掉旧的培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3～5次，加入新的培养液，再加入Hoechst33342至终浓度为5 μg/ml，37℃避光孵育90 min，倒掉旧的培养液，加入新鲜培养液1 ml，倒置荧光显微镜下观察并拍照(随机选取5×200倍视野，分别计数100个细胞，计算SP细胞所占的比例)。重复6次。

1.5 免疫细胞化学 将两组细胞分别爬片处理，PBS冲洗，冷丙酮固定10 min。按SP-9000试剂盒步骤检测Nanog。用已知阳性的精原细胞切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。随机选取5×200倍视野，分别计数100个细胞，计算阳性细胞所占的比例。重复6次。

1.6 Transwell体外侵袭实验 利用Transwell小室进行SGC7901细胞体外侵袭力的测定:4℃溶解Matrigel，每孔50 μl加入预冷的Transwell小室的上室中，胰酶溶解消化细胞，用含1%牛血清白蛋白的培养液调整细胞密度至1×106ml－1，每孔200 μl加入各孔上室。余下按使用说明操作，完成后随机于100倍光镜下取上、下、左、右中心5个视野，计算穿膜细胞，取其平均数。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行t检验。

2 结果

2.1 顺铂干预后SGC7901细胞中SP细胞的比例Hoechst33342染色后，荧光显微镜下可见SP细胞的胞核较大，呈圆形或椭圆形，淡然或者低染。与对照组(2.43%±0.62%)相比，实验组SP细胞比例(5.54% ±1.66%)增高(P＜0.05)。

2.2 顺铂干预后Nanog表达 对照组Nanog蛋白主要表达在胞质，染色细胞少且弱，核内少见表达。而实验组细胞表达增多且强，核表达细胞数目增多。实验组 Nanog蛋白表达(79.15% ±10.33%)较对照组(55.23% ±3.67%)明显增高(P＜0.05)。

2.3 顺铂干预后SGC7901细胞侵袭力 实验组穿膜细胞数〔(63±8)个〕较对照组〔(42±7)个〕明显增多(P＜0.05)。

3 讨论

现阶段，化疗仍然是临床治疗胃癌的主要手段之一。虽然化疗的方案各有不同，但大多含有顺铂。目前化疗的效果并不理想，一般只能短期控制肺癌的发展，无法根治胃癌，而且由于后期往往产生明显的耐药性，胃癌细胞可能出现加速生长，很快发生侵袭转移等现象。CSC学说的确立为肿瘤的研究和治疗带来了新的理念〔5，6〕。CSC在肿瘤的异质性中处于“塔尖”的位置，与耐药性的形成也有着密切的关系〔7〕。Pan等〔8〕证实，肺癌CSC比肿瘤内其他成熟癌细胞对化疗更具有抗药性，导致化疗方案无法彻底治愈肺癌。类似的结果还在肝癌等肿瘤中得到证实〔9〕。

Nanog是目前公认的CSC标志性基因，其表达与CSC的自我增殖等能力密切相关。在乳腺癌、结肠癌、肺癌的研究中都证明〔10〕，Nanog与CSC的关系密切并影响着这些肿瘤的生物学行为、转移、复发、治疗及预后，Nanog在CSC中的表达明显高于肿瘤内其他成熟癌细胞。肿瘤中Nanog高水平表达者往往进展快、易发生转移，预后差。

本研究说明相比于普通的胃癌细胞，CSC对以顺铂为代表的化疗药物有更强的耐受性。CSC的存在与肿瘤化疗的耐药性有着密切的关系。推测顺铂只能有效杀死普通胃癌细胞，而对CSC没有明显杀伤作用。因此，用药后CSC反而以更快的速度生长，表现为比例的增加，表现出明显的恶性肿瘤生物学特性，提示其参与了耐药性的发生。但胃癌耐药性的发生是否完全归咎于CSC，需要进一步研究。

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