兰花的分子标记研究进展

魏 霜 袁俊杰 程文杰 林利平 李小健* 鄞杰平 黄锦炎 刘碧琳 刘晓莹

（1.汕头出入境检验检疫局 广东汕头 515041；2.湛江出入境检验检疫局；3.湖北省咸宁市园林绿化管理局）

1 前言

兰花是兰科兰属中一些多年生草本植物的统称，主要种类有春兰、惠兰、建兰、墨兰、寒兰等，具有极高的观赏价值和经济价值。我国是野生兰花资源大国，约有173属1200多种和大量的变种等。近年来，随着国内农业产业结构的调整，以出口兰花生产为主的产业悄然兴起，兰花出口数量增长迅速，主要贸易种类有蝴蝶兰、大花蕙兰等。由于在口岸检疫中，兰花品种的鉴定非常重要，而传统分类的依据是形态学特征，存在主观意识，极易影响分类结果的准确性。因此，分子标记技术的快速发展为兰花的分类研究开辟了新途径，对缩短检疫鉴定时间、防止优良物种资源的流失等具有重要意义。

本文针对主要分子标记技术及其衍生技术在兰花分类（种以下）中的应用进行综述，分析各个技术的应用情况及优缺点，并对分子标记技术作为口岸实验室兰花分类的一个重要补充提出展望。

2 分子标记

分子标记是以个体间DNA碱基序列变异为基础的遗传标记，相比其他遗传标记而言具有不受环境、组织类别、发育阶段等方面影响的优点，而且多态性高、数量多，可作为形态学分类的一个重要补充。随着分子生物学技术的发展，目前分子标记技术已有数十种。按照传统以检测手段分类，大致可分为4大类型：以PCR技术为基础、以分子杂交技术为基础、以PCR技术与限制性酶切技术结合和基于单核苷酸多态性[1]；按照Andersen等[2]根据其基因组来源不同，可分为3类：随机分子标记（Random DNA markers,RDMs）、目的基因分子标记（Gene-targeted markers,GTMs）和功能性分子标记（Functional markers,FMs）。主要的分子标记包括：限制性内切酶片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism,RFLP）、随机扩增多态性（Random amplified polymorphic DNA,RAPD）、扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism,AFLP）、简单重复序列（Simple sequence repeat,SSR）、单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms,SNP）等。目前，这些分子标记技术已被广泛应用于兰花的遗传标记中，对兰花的分类鉴定起到了重要作用。

3 主要分子标记技术

3.1 RFLP

作为第一代分子标记技术的代表，RFLP已被广泛应用于多种生物学科的研究，它主要是利用限制性内切酶将基因组DNA酶切后电泳转膜，然后利用探针杂交。在植物遗传标记应用中，RFLP遍布低拷贝编码序列，而且其标记结果非常稳定，但检测过程复杂、成本高，目前很少学者将其用于兰花的分类标记，多数与PCR联用降低检测成本和周期。蹇黎等[3]利用PCR-RFLP针对21个兰花叶绿体基因和线粒体基因进行分析，其结果与形态学分类基本吻合，证明该方法对兰花的分类具有辅助作用。虽然RFLP作为经典分子标记技术的结果准确性高，但其缺点限制了大规模使用。将RFLP与PCR技术联用后可明显改善其缺点，但依然需要PCR扩增、多种限制性内切酶酶切、凝胶电泳这3个步骤，操作比较繁琐，应用范围不广。

3.2 RAPD及其衍生技术

RAPD是由Williams等[4]于1990年开发的一种基于PCR的分子标记技术，它以人工合成的随机引物（通常为10个碱基）进行PCR扩增，经电泳分析结果。相对于RFLP，RAPD大大减少了工作量。国外大量应用实例均证明RAPD适合于兰花遗传分析[5-6]；在国内，梁红建等[7]最早利用RAPD对19个中国兰花进行瓶中鉴定和分类研究，发现RAPD的分析结果与传统分类学的结果基本相符，表明该技术适用于兰花的分类鉴定；此后，大量学者利用RAPD对叉唇虾脊兰[8]、蝴蝶兰[9]、秦岭野生蕙兰[10]等兰花品种进行分析，均认为RAPD对兰花分类具有一定的指导意义。虽然RAPD在可重复性上存在问题，但操作便捷、同一实验条件下结果可比性等优点，使其依然成为传统分类学外的重要补充。

RAPD是基于随机引物扩增来分析多态性，引物的Tm值低导致PCR的重复性差。针对这一问题，Li等[11]于2001年开发了相关序列扩增多态性（Sequence-related amplified polymorphism,SRAP）技术，该技术设计了独特的引物对内含子区域、启动子区域进行特异性扩增，根据它们之间的间隔区长度不同而产生多态性。相对于RAPD，SRAP增强了特异性，而且产生的片段在需要时可以克隆测序，目前国内已有学者将其用于兰花的遗传分析，并对反应体系进行了优化[12]；蹇黎等[13]利用SRAP对37个中国寒兰和14个日本寒兰品种进行聚类分析，结果表明51个品种可划分为中国寒兰和日本寒兰两大类群，证明该技术适用于兰花植物遗传多样性和亲缘关系研究；Cai等[14]人对7种濒危兰花用17条SRAP引物进行分析，共产生231条清晰条带，其中有187条多态性条带，结果表明SRAP适用于兰花遗传标记；在SRAP的基础上，Hu等[15]开发了靶位区域扩增多态性（Target region amplified polymorphism,TRAP）技术，通过进一步改进引物的设计来获得更高的多态性和可重复性，但该技术目前尚未在兰花遗传分析中应用。

3.3 AFLP

针对RAPD可重复性差这一问题，Zabeau等[16]于1992年开发了AFLP分子标记技术，它将基因组DNA用限制性内切酶酶切后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列作为引物的结合位点进行PCR扩增。AFLP综合了RFLP的可靠性和RAPD的高效性，国内学者利用其对春剑[17]、中国墨兰[18]、春石斛[19]等兰花品种进行了分析，均获得较好效果。AFLP虽然不如RAPD简便，但相对于RFLP大大减少了工作量，而且结果可重复性高，目前应用较为广泛。

3.4 SSR及其衍生技术

SSR技术主要过程是根据重复序列两端互补序列设计引物进行PCR扩增，根据电泳产物大小来判断重复次数，目前亲子鉴定一般采取该方法。SSR有许多优点，包括所需DNA量少、能够鉴别杂合子和纯合子等，但采用时必须知道重复序列两端的DNA序列以设计引物，这导致其开发难度较大，目前SSR已经被用于兰花的遗传标记，Moe等[20]开发了14个新的SSR位点引物并用于分析96个兰花品种，结果显示建立的SSR方法能够应用于兰花的遗传分析；国内也有学者开发了一系列SSR位点用于兰花遗传分析[21-22]。SSR虽然开发难度大，但一旦开发后可以在不同实验室共享，这对全世界兰花资源的不同实验室数据对比和统一分析极具意义，而且该技术可以实现多重PCR检测，提高分析通量和自动化程度，这也将是未来分子生物实验的一个重要趋势。

有学者对SSR技术进行改进，开发了表达序列标签（Expressed sequence tags,EST）来源的ESTSSR技术。该技术与SSR的区别在于前者来源于基因组编码区，因此更能够反映植物基因组功能的信息，而且EST-SSR具有在植物物种之间可转移性的优点，开发难度低于SSR，目前已被应用于兰花的分子标记。Huang等[23]利用EST-SSR对103种栽培中国兰花进行了分析；也有学者针对蝴蝶兰已公布的EST数据进行SSR分析挖掘[24]，但相对来说对其开发依然较为匮乏。随着关于兰花EST数据的不断更新，大量数据会提供更多的SSR信息，这将为EST-SSR技术的开发提供有利条件，从而使其得到广泛应用。

开发难度较大限制了SSR的应用，为了克服该缺点，Zietkeiwitcz等[25]在SSR基础上开发了简单重复序列间多态性（Inter simple sequence repeat,ISSR）技术，其主要优点在于不需要知道重复序列两端的序列，这对于一些遗传研究背景较少的物种非常有利。ISSR的开发费用较低，其引物类似于随机引物，可以在不同的物种间通用。因操作简便，已有大量学者将其应用于兰花的遗传学分析中，但不同兰花品种须建立各自优化的反应条件。

3.5 SNP

SNP是指在基因组上因单个核苷酸的变异包括置换、缺失、插入和颠换而形成的遗传标记，其数量多、多态性高，目前已经证明其与人体表型差异、疾病等方面密切相关。目前，SNP在植物的研究中仍处于起步阶段，除了少数几种植物如水稻、玉米和拟南芥有较深入的研究外，其他植物研究较少，但其应用潜力不容忽视[26]。

3.6 其他衍生技术

有许多在上述分子标记基础上衍生出来的技术，如结合了RAPD和SSR技术的随机微卫星扩增多态DNA（Random microsatellite amplify polymorphic DNA，RMAPD）[27]，能通过几对引物的扩增，获得清晰、稳定的条带，且操作快速、简便。RMAPD使兰属亲缘关系的分析更为迅速有效[28]，目前已被成功应用于兰属植物间的亲缘关系分析，12对引物所产生的特异性谱可区分16种兰属植物。结合了RFLP和SSR技术的数目可变串联重复序列（Variable number of tandem repeats,VNTR）[29]，同样已被用于兰花的遗传分析[30]。贾琳等[31]将直接扩增片段长度多态性（Direct amplification of length polymorphisms,DALP）应用于莲瓣兰的遗传多样性研究，5个引物组合共检测到103个多态位点。李亚等[32]综述了核rDNA基因内转录间隔区（Internal transcribed spacer,ITS）分子标记在兰科植物中的应用，虽然有些兰科植物由于遗传变异等原因在rDNA ITS区域差异较小，不能进行有效区分，但随着该技术的不断发展，它必将成为兰科植物资源鉴定的一种重要方法。

4 讨论

以上各种技术各有其优缺点，许多学者对它们进行了对比。Garcia等[33]为了寻找对玉米多样性研究最有效的分子标记方法，利用RAPD、RFLP、AFLP和SSR 4种技术对18种玉米进行分析，综合结果认为AFLP是玉米指纹图谱和多样性分析的最佳方法；Powell等[34]于1996年报道当时4大分子标记技术的综合效用大小顺序为AFLP、SSR、RAPD、RFLP；王慧中等[35]利用RAPD和AFLP技术分析了兰属14种植物的遗传多样性，结果显示虽然两种标记技术所得数据有所差别，但分析结果基本一致。无论是兰花还是其他植物，学者们都认为AFLP技术的综合效用最佳。当然，在各个技术的基础上也都产生了一些衍生技术，这些衍生技术继承了原技术的优点，在一定程度上解决了原技术的缺点，具有重要的实用价值，但是各个技术的侧重点不同，需要根据实验目的选择合适技术。

目前对兰花的遗传学分析上大多数利用RAPD技术，在同一实验室内使用该技术既方便结果又具有可比性，确为实验室内部对兰花分类鉴定的一个重要补充方法。但从宏观上来看，兰花资源丰富，遍布全世界，这些资源必然需要利用分子标记方法分类整合在一起才有利于兰花资源的开发，因此，不同实验室结果可对比性显得尤为重要，技术的可重复性必将是分子标记技术中一个非常重要的方面。曾经在一段时间内，由于当时已有物种基因序列的数据量缺乏，SSR及其衍生技术陷入瓶颈期，但由于第二代测序技术的迅猛发展，各个物种核酸序列大量增加，这些可以直接分析利用的数据极大地推动了SSR的发展[36]；另外多重PCR、毛细管电泳等技术与SSR相结合提高了检测的通量和检测灵敏度，让一次检测分析多个位点成为可能，使分析结果更为准确。SNP作为第三代分子标记技术，具有极大的应用潜力。

在口岸实验室中，分子标记技术作为补充用于兰花分类时，对技术的简便性要求很高，RAPD和ISSR非常适合于这一要求。目前尚无一种分子标记技术能够达到理想分子标记的要求，所以有学者针对现有分子标记技术存在的优缺点，提出将多种分子标记技术同时应用，以便进行全面分析。例如Xue等[42]人就将RAPD和SRAP两种技术联用以分析钩状石斛和铁皮石斛，使结果更为准确。因此，多种简单技术联用将是口岸实验室对兰花辅助鉴定的一个重要方向。

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