固相萃取-气相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中肌醇含量

曾 静 时逸吟* 张孝刚 唐 玲 朱 坚 伊雄海 邓晓军 曲 栗

（1.上海出入境检验检疫局 上海 200135；2.遵义医学院公共卫生学院）

1 前言

肌醇（Inositol）又叫1α，2α，3α，4β，5α，6β-环己六醇，分子式为C6H12O6，结构式如图1。肌醇是饱和环状多元醇，易溶于水，广泛存在于各种天然动物、植物及微生物组织中[1]，具有类似维生素B1和维生素H的作用，能促进脂肪代谢，防止肝脏脂肪积累，加速除去肝脏过多脂肪，对脂肪肝、肝炎、肝硬化症、糖尿病、肥胖症等疾病有治疗和预防作用[2]。因此，肌醇可作为食品营养强化剂，被允许在调制乳粉（仅限儿童用乳粉）、果蔬汁（肉）饮料（包括发酵型产品等）和风味饮料限量添加[3]，其中国家标准《婴幼儿配方食品》（GB 10765-2010）规定婴幼儿配方食品中肌醇的添加量为1.0-9.5mg/100kJ[4]。

图1 肌醇分子结构

目前有关文献报道的肌醇检测方法有重量法、高碘酸钾氧化法、微生物法、液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）、气相色谱-质谱/质谱法（GCMS/MS）[5-14]。这些方法中，重量法所需样品量大，操作繁琐；高碘酸钾氧化法需要严格控制加热氧化时间；微生物法耗时长；HPLC法的分离效果不如GC法，检测结果误差较大。食品安全国家标准《婴幼儿食品和乳品中肌醇的测定》（GB 5413.25-2010）[15]明确规定婴幼儿食品和乳品中肌醇含量的测定方法为微生物法和气相色谱法

，国家推荐标准《保健食品中肌醇的测定》（GB/T 5009.196-2003）[5]采用的方法也是硅烷化处理后气相色谱检测法。但是由于奶粉基质复杂，杂峰会干扰目标化合物，从而影响检测结果的准确性。

本研究按照国家标准检测步骤，采用固相萃取技术，以期通过优化肌醇测定的前处理过程，找到现有方法中杂峰干扰的解决办法。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试验材料市售奶粉。

2.1.2 试剂

肌醇标准品：纯度≥99%，购自Sigma公司；N,N-二甲基甲酰胺、六甲基二硅胺烷、三甲基氯硅烷、正己烷、无水乙醇：均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

2.1.3 仪器设备

Agilent 7890A气相色谱仪：带FID检测器，安捷伦科技有限公司；HWS28电热恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司；centrifuge 5810R离心机：德国Eppendorf公司；氮吹仪：美国Zymark公司；旋转蒸发仪：瑞士BUCHI公司；涡旋振荡器：VISION SCIENTIFIC CO.，LTD；超声波清洗仪：德国Elmasonic；LC-Florisil固相萃取小柱（1g/3mL）、LC-CN固相萃取小柱(1g/3mL)：上海安谱科学仪器有限公司。

2.2 方法

2.2.1 肌醇标准溶液（0.010mg/mL）配制

称取100mg（精确到0.1mg）肌醇标准品，经105℃烘干2h，用25mL水溶解完全，95%乙醇定容至100mL；取1mL此溶液，用70%乙醇定容至100mL。

2.2.2 气相色谱条件

色谱柱：SP-2560毛细管柱（100m×0.25mm，0.2μm）；进样口温度：280℃；进样方式：分流进样；分流比：10:1；柱温：120℃保持0min，以10℃/min升到190℃，保持20min，再以10℃/min升到220℃，保持3min；检测器：FID（氢火焰离子检测器），温度300℃；H2流量：30mL/min；空气流量：400mL/min；尾吹流量（N2）：25mL/min。

2.2.3 样品处理

参照国家标准GB 5413.25-2010[5]。称取试样1g(精确到0.0001g)于50mL容量瓶中，加入12mL40℃温水溶解试样；超声提取10min，用95%乙醇定容；取10mL于15mL离心管中，离心5min；取上清液5mL旋转蒸发至干，加入10mL硅烷化试剂，超声溶解，于80℃水浴中衍生反应75min；取出冷却至室温，加入5mL正己烷，振荡混合，取上清液供气相色谱测定。

2.2.4 标准曲线的制备

分别吸取0.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL肌醇标准溶液于浓缩瓶中，按照2.2.3步骤操作。

2.2.5 固相萃取柱的选择及净化条件和步骤

分别采用LC-CN固相萃取小柱和LC-Florisil固相萃取小柱净化处理样品后，再进行干燥与衍生的后续分析。固相萃取净化条件和步骤：选用5mL乙醇对固相萃取柱进行活化，5mL 70%乙醇进行平衡，然后加1mL提取液上样，先以1mL 乙醇淋洗，弃去淋洗液，再以2mL 70%乙醇洗脱，收集洗脱液。

2.2.6 样品测定

分别将待测液注入到气相色谱仪中，按上述色谱条件进行分析。

2.2.7 结果计算

外标法定量，计算样品中肌醇含量。

3 结果与讨论

3.1 肌醇标准曲线

根据标准曲线步骤测定，以肌醇浓度（0，0.004mg/mL，0.008 mg/mL，0.012 mg/mL，0.016 mg/mL，0.02 mg/mL）为横坐标，以气相色谱峰面积为纵坐标，绘制肌醇含量测定的标准曲线，如图2。肌醇标准曲线测定的代表性图谱如图3。

图2 肌醇的标准曲线

图3 肌醇标准曲线测定代表性图谱（肌醇浓度0.016mg/mL）

图2显示，在0-0.02 mg/mL范围内，肌醇浓度和肌醇检测色谱峰面积具有良好的线性相关性，r为0.9996。在此浓度范围内，能够实现对肌醇的准确定量检测。

3.2 不同固相萃取柱处理样品对肌醇测定的影响

通过添加10 mg/100g水平，比较国标法（不经固相萃取柱净化）和本方法（经净化）的分析结果（图4）以及LC-CN Spe小柱和LC-Florisil Spe小柱柱效（图5）。

图4 未经SPE净化与经净化对样品处理对比图

图5 两种小柱对样品净化效果对比图

图4显示，国标法中由于样品不经净化处理，所以杂峰较多，对实际样品的测定有一定干扰，样品出峰前有其他尾峰影响峰面积；本方法中经净化处理的样品杂峰较少，受样品基质影响小。图5显示，两种小柱对样品净化效果无显著差异，均能达到对实际样品的净化，减少杂质。实际测定数据见表1。

表1 2种固相萃取小柱分析结果

根据实验室质量控制规范食品理化检测标准[16]，回收率最好在95-105%。表1显示，LC-CN 固相萃取小柱表观回收率较高，超过105%，这可能是净化不完全导致；而LC-Florisil 固相萃取小柱回收率基本在95-105%范围内，同时过LC-Florisil固相萃取小柱比LC-CN固相萃取小柱快。这是因为肌醇是极性物质，LC-Florisil固相萃取柱是极性柱，经淋洗后试样中的肌醇被LC-Florisil固相萃取柱吸附，而杂质则随淋洗液流出并弃之。

3.3 衍生前后固相萃取处理样品对肌醇测定的影响

根据国标中肌醇的测定步骤，选择LC-Florisil固相萃取小柱、固相萃取净化条件和步骤，分别于衍生前处理样品和衍生后处理样品，分析2种处理对分析结果的影响。测定结果见表2，分析图谱见图6。

表2 衍生前后固相萃取处理样品对肌醇测定的影响

图6 衍生前后固相萃取处理样品对肌醇测定的影响

通过分析可知，衍生前净化与衍生后净化对样品中肌醇含量测定结果的影响无显著差异，均具有较高的准确性和重现性。但仅从数字看，衍生前进行样品净化具有更好的效果。

3.4 实际样品测定

采用国标法和本方法（选择LC-Florisil 固相萃取小柱）分别对样品1、样品2进行不同添加水平（样品1：5mg/100g，10mg/100g；样品2：10mg/100g）测定，结果见表3（每个结果均为6次平行测定的均值）。

表3 2种方法对实际样品中肌醇含量的测定结果（mg/100g）

表3显示，采用国标法测定样品中肌醇含量，回收率为99-100%，各次重复测定标准差<5%；而本方法测定结果准确性和重现性好，平均回收率为95%-98%，各次重复测定标准差也<5%，与国标法相比，没有显著性差异。

基于本方法能够除掉样品中大部分杂质，减少杂质峰的干扰以及对仪器的损伤，因此可采用本方法测定婴幼儿配方奶粉中的肌醇含量。

4 结论

本研究采用LC-Florisil 固相萃取小柱对试样进行净化处理，浓缩，经硅烷化试剂衍生，处理好的试样供气相色谱仪（带FID检测器）进行测定。结果显示，本方法能够除掉样品中大部分的杂质，色谱杂峰较少，受样品基质影响小，样品检测结果回收率在95%-98%，且各次重复测定标准差<5%，可以满足奶粉样品中肌醇含量的准确测定；分别采用国标法和本方法对样品中肌醇含量进行测定，结果显示两种方法无显著性差异。

［1］郭会灿，王素娟，郭英.肌醇的研究进展[J].河北化工，2008，31 (7):5-7.

［2］姜瑞清，李梅，常建军，等.气相色谱质谱联用法检测牛奶及奶粉中肌醇[J].食品工业科技，2010，31(10):375-376，379.

［3］GB 14880-2012 食品营养强化剂使用标准[S].

［4］GB 10765-2010 婴幼儿配方食品[S].

［5］GB/T 5009.196-2003 保健食品中肌醇的测定[S].

［6］严拯宇，姜新民，黎红梅，等.程序升温气相色谱法测定肌醇的含量[J].江苏药学与临床研究，2002，10(4):16-18.

［7］王咏梅，金晓英，袁东星，等.高效液相色谱法直接测定样品中肌醇的含量[J].食品科学，2001，22(7):1075-1076.

［8］黄伟雄，梁富荣.肌醇硅烷化反应的质朴研究[J].华南预防医学，2002，28(6):52-53.

［9］李磊，黎源倩，王和兴.毛细管气相色谱法同时检测保健食品中的肌醇和葡萄糖[J].中国卫生检验杂志，2005，15(12):1419-1421.

［10］黄芳，曲彩红，吴慧勤，等.气相色谱-质谱法测定螺旋藻中肌醇的含量[J].南方医科大学学报，2006，26(7):1075-1076.

［11］任清，张阳.衍生化-毛细管气相色谱法同时测定糖尿病大鼠坐骨神经中葡萄糖、山梨酸、肌醇[J].分析实验室，2004，23(6):19-21.

［12］齐文娟.高效液相色谱法对预饲料样品中肌醇含量的测定[J].江西饲料，2005，4:22-23.

［13］赵凯，孙岚，李玮，等.气相色谱质谱法测定功能性饮料中的肌醇[J].分析实验室，2009，28（5）:22-124.

［14］胡佳林，张雪峰，崔涛，等.气相色谱-质谱/质谱法测定牛奶和奶粉中的肌醇[J].中国乳品工业，2011，39(8):47-49.

［15］GB 5413.25-2010 婴幼儿食品和乳品中肌醇的测定[S].

［16］GB/T 27404-2008 实验室质量控制规范 食品理化检测[S].