精子DNA碎片化检测在男性生殖领域的临床应用

陈 亮 徐 阳

北京大学第一医院生殖与遗传医疗中心（北京 100034）

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精子DNA碎片化检测在男性生殖领域的临床应用

陈 亮 徐 阳

北京大学第一医院生殖与遗传医疗中心（北京 100034）

人工授精（IUI）、体外受精（IVF），特别是胞浆内单精子注射（ICSI）等辅助生殖技术（ART）的广泛应用，解决了严重精子异常不育患者的受精难题[1-3]。由于精液常规分析（SA）只是对于精子的活动率及形态进行大致的分析，对ART诊疗策略的制定及助孕结局预测评估的作用价值非常有限。从分子层面检测精子DNA损伤程度、选择DNA损伤较小的精子对提高ART妊娠成功率大有裨益。虽然精子DNA损伤碎片化检测尚处于初步探索阶段，对其认知存在不同学术观点，具体发生机制尚未完全明了，但不可否认，越来越多的研究结果提示精子DNA损伤性检测对于评估男性生育力及预测ART结局显示出不可低估的作用。本文对精子DNA损伤碎片化检测研究动向及其在男性生殖领域内的临床应用做一述评。

一、精子DNA损伤导致碎片化的病因及发生机制

精子DNA损伤是指在精子生成及成熟过程中，各种原因导致DNA完整性被破坏而产生断裂的碎片。精子DNA损伤也是多因素共同作用、精子自身抗损伤机制失衡导致的结果，与生殖道感染、睾丸温度升高、精索静脉曲张、放疗及化疗、吸烟、激素及环境污染包括天气雾霾等因素有关。雾霾天气中重金属及有害物质会导致精子DNA链断裂和甲基化增多。香烟中含有尼古丁、可尼丁、苯并芘、一氧化碳、镉等有害物质不仅影响睾丸Leydig细胞睾酮合成及分泌，更能直接导致精子DNA链断裂导致精子损伤[2-7]。精子DNA碎片化的发生信号调控机制尚不完全明了，但目前研究提示，精子发生过程中染色质组装异常、有害刺激因素诱导的过度氧化应激、异常凋亡等多种机制参与、协同作用导致了精子DNA完整性损伤[2]。

（一）精子染色质组装异常

精子与体细胞的核蛋白（主要是组蛋白）不同，成熟精子的核蛋白主要为鱼精蛋白（富含精氨酸和半胱氨酸的碱性蛋白）。在精子发生周期中期，存在组蛋白被鱼精蛋白替换机制，这一机制是一把“双刃剑”，一方面，有利之处在于精子细胞核凝集程度大大增加，形成精子DNA超螺旋结构，达到高度浓缩、凝集的特殊结构形式，而能保持较强穿透卵子透明带的能力；但另一方面，这一过程也降低了其本身应对内外环境损伤的修复能力。易被来自内外环境的各种有害因素所干扰，DNA双链超螺旋折叠压缩过程中产生的扭曲应力修复异常，导致精子DNA碎片化及染色质结构损伤。组蛋白向鱼精蛋白转化异常将会损伤精子DNA完整性，干扰生精过程及受精后胚胎早期发育[2,8,9]。

（二）氧化应激

精子正常代谢形成多种氧化产物（活性氧类物质，ROS），同时，机体存在抗氧化系统，氧化系统和抗氧化系统之间能够保持动态平衡，使得机体到达“稳态”。适当水平的ROS有助于精子获能和顶体反应。当ROS大量存在，超过了抗氧化系统的清除能力和精核独特紧密结构的防御能力时，导致精子DNA产生单链或双链的断裂，造成精子DNA损伤。而且，由于精子膜含有高浓度的不饱和脂肪酸、低浓度的ROS清除酶，在过量ROS的攻击下易发生脂类过氧化反应。使脂肪酸失去双键（这些双键对于维持精子膜的流动性又是必不可少的），进而精子膜失去流动性，最后导致DNA变异或断裂。研究显示精子暴露在外源性ROS时，DNA断裂明显增加，导致无碱基位点、缺失、DNA交联及重排等[10]。精索静脉曲张、类固醇激素、雾霾、吸烟等都可能通过诱导氧化应激导致精子DNA损伤[9,10]。

（三）凋亡机制异常

凋亡即细胞程序性死亡，是真核生物有核细胞的一种主动性生理过程，是由体内外因素触发细胞内预存程序而导致的细胞生理性主动死亡过程。凋亡机制是机体的“清道夫”，能将损伤的细胞器及外来有害物质主动清除，维持细胞代谢稳态。精子细胞表面表达凋亡蛋白Fas，Fas/FasL信号途径可能调控精子凋亡。研究发现不育男性精子表面Fas蛋白表达增加，提示精子未能启动正常的凋亡以清除DNA受损的精子，导致精子DNA损伤进一步加剧[11]。凋亡会启动内源性凋亡激酶及核酸酶的级联反应，这些信号级联调控发生异常，会导致精子启动凋亡程序异常，进而导致DNA损伤[11]。但对于凋亡机制与DNA损伤的因果关联，尚需分子生物学水平的详细解析。

二、精子DNA损伤检测方法

目前尚缺乏规范和统一的方法和标准，现有的各种DNA损伤的检测方法各有利弊。常用的精子DNA损伤检测方法包括精子染色质结构分析试验（SCSA）、彗星实验（Comet assay）、末端转移酶介导的dUTP末端标记法（TUNEL）、精子染色质扩散试验（SCD）、荧光原位杂交（FISH）、原位缺口平移法（ISNT）以及和聚合酶链式反应（PCR）等。SCSA反映了不同精子染色质构象结构的异质性，该方法快速、简便，但检测精子标本量的需求较大，需要使用流式细胞仪。Comet分析试验是在精子细胞水平检测DNA损伤的方法，可直接对单个精子单双链的断裂损伤进行定量，所需精子数量少，灵敏度高，但操作复杂。TUNEL法运用分子生物学及免疫组化相结合检测凋亡精子的DNA片段，能用于细胞凋亡的研究，但操作较为复杂。SCD法简单、快捷、但目前还难以实现自动化检测。FISH用已知的荧光标记核酸探针与处理后待测的精子染色体进行杂交，检测精子染色体异常及非整倍体率的分析，方法简便，特异度高。PCR能更精细地研究精子DNA的完整性是否缺失、点突变等[12-14]。这些检测方法之间有较好的相关性，但在检测内容方面尚存在某些差异性。

三、精子DNA完整性检测与SA的比较

SA（精子浓度、活动率和形态学）的指标只能反映最基本的精液质量，各参数波动范围较大，从形态和数量方面进行分析，而对精子功能和受精能力方面提供的信息有限。因此，常规SA并不能完全反映精子是否具有正常的受精能力，也不能很好地预测精子的受精潜能。与SA比较，DNA损伤性检测的变异系数更低：同一患者两周内连续2次标本中精子DNA损伤的变异系数明显低于常规SA（精子浓度、精子活动率），且同一份标本重复测定精子DNA完整性的变异系数较小。在预测男性生育能力方面，精子DNA损伤分析可能是比传统常规SA参数更稳定、更敏感。 更有研究认为精子染色质或DNA完整性可能是精子质量的独立预测指标，作为精子质量临床评价标准具有优越的可行性[12-14]。DNA碎片与精子浓度没有关联，即SA大致正常的患者其精子DNA碎片化指数（DFI）也可能很高。Moskovtsev等[15]研究结果表明，精子DNA损伤与精子浓度、活动率、正常形态率呈显著负相关。在精子形态学的指标中，精子形态异常与DNA断裂有关，尤其精子头异常与DNA损伤有显著相关性[16,17]。可见，对于男性不育患者，除了SA之外，精子DNA检出对预测其精子质量提供了分子生物学层面的依据。

四、精子DNA完整性检测在体内受精中的预测作用

体内受精包括自然受孕和宫腔内人工受精（IUI）。男方精子DNA损伤率超过30%，夫妇自然受精率很低。而且当精子DNA损伤率高于30%时（SCSA法），自然妊娠率和宫腔内人工授精的妊娠率几乎为零[18-20]。Duran等[20]通过TUNEL法研究发现，IUI时精子的DFI＞l2% 的配偶均未获得妊娠。故认为，检测精子DFI水平可预测IUI的成功率。对于IUI反复失败患者，应检测DNA碎片化程度，并针对相关因素进行干预以提高精子DNA完整性，或改行IVF及ICSI。

五、精子DNA损伤在体外受精中的预测价值

精子DNA损伤与体外受精受孕率和胚胎质量呈负相关，通过精子DNA碎片可预测IVF的成功率[21]。Henkel等报道，即使精子DFI没有影响到受精率和体外培养胚胎碎片发生率，但当TUNEL阳性（＞36.5%）时IVF患者的妊娠率仍很低[22]。相关研究对初次行IVF或ICSI的622对夫妇精液样本采用SCD法测定精子DNA断裂水平，结果也发现精子DNA断裂率与受精率呈负相关，并指出其阈值为18%，胚胎质量与精子DNA损伤有关，但临床妊娠及分娩率与DNA损伤之间并没有相关性[23]。国内的研究结果提示DNA碎片率与IVF受精率和优质胚胎率均存在显著负相关[24]。但是，也有相反的意见，Borini等利用TUNEL法检测IVF及ICSI患者的精子DNA损伤，并探讨精子DNA损伤与IVF及ICSI结局的关系，发现IVF患者的临床妊娠率与精子DNA损伤亦无显著相关性，而ICSI患者的临床妊娠率与精子DNA损伤呈显著正相关[25]。另外研究发现精子DNA断裂率与常规IVF受精率无关，而仅与ICSI受精率呈负相关，可能是因为用于ICSI的精子绕过了精卵自然选择过程，有可能将DNA断裂水平高的精子注入卵子有关，其结果可进一步影响ICSI后的胚胎质量和临床妊娠率[26]。但目前精子DNA完整性对IVF技术受孕率的影响尚有争议。

六、精子DNA损伤与妊娠结局及子代健康的关联

随着精子DNA损伤程度的增加，可能会发生受精后的妊娠丢失，如临床上某些常见的反复原因不明的妊娠丢失或不良妊娠结局。持反对意见的学者认为不同DFI水平与IVF、ICSI受精率、优胚率、妊娠率均无关，但与自然流产率有关[27]。Muriel等对85例需体外受精-胚胎移植（IVF-ET）、ICSI助孕的不孕症患者，采用SCD法检测精子DNA损伤，探讨精子DNA损伤与ART结局，结果发现DNA断裂率越高，受精卵原核核仁前体发育不同步性也随之增高；DNA断裂高水平组胚胎发育速度缓慢并且形态异常的比例高；但IVF妊娠组与非妊娠组的SCD结果差异无统计学意义（P＞0.05），考虑与受精以及植入前的胚胎自然选择过程有关[28]。文献报道接受ICSI治疗的患者，其后代染色体异常的比例（1.6%）高于正常受精后分娩的婴儿（0.5%），出生缺陷的风险亦高于正常人群[29]。应用DNA损伤严重的精子时，胚胎可以植入宫内并继续发育，也可能会发生胚胎发育中断或自然流产。即使当精子DNA损伤程度较轻时，胎儿发育也可能受影响，甚至导致子代先天畸形。 关于精子DNA损伤与IVF/ISCI术后妊娠丢失相关的系统评价及Meta分析指出[27]：精子DNA损伤对子代健康产生不良影响，会导致子代寿命减短，行为异常增加、病理情况显著增加、后代癌症罹患率增高、显性基因突变增加。因此，在进行ICSI前，对精子DNA进行评估十分必要。英国生殖医学会的推荐指南：精子质量差能干扰助孕技术成功率，建议助孕周期过程中进行精子DNA损伤的检测。

七、精子DNA检测的局限性

目前对于精子DNA损伤的机制及对生育结局的影响还存在众多未解之谜，观点上也存在争论，其局限性包括目前尚未能真正建立有效的临床应用体系，因为众多支持性研究都是小样本的，并且研究类型各异，证据不足。实验室人员目前还缺乏有效培训，很多检测方法还不能临床常规性应用。目前精子DNA检测并不能提供特异性的DNA序列预测，或许是其短板所在。另外，有观点认为，即使能够检测出精子细胞核内存在DNA碎片，那又能如何? 因为目前尚无特效治疗及预防精子DNA碎片化产生的方法。因此，有学者认为如果是仅仅检测及确定精子DNA碎片而却“束手无策”，就没必要浪费人力及物力去开展。但也有研究发现相应的对症治疗如药物抗氧化、必需微量元素补充、纠正吸烟等不良生活方式等，对于减低及恢复精子DNA碎片化、改善妊娠结局还是有益的[30]。

综上所述，随着ART的发展，由于其局限性，单纯传统的SA分析已不能满足需要，急需新的检测方法来预测精子的受精能力及对胚胎的影响。精子DNA损伤程度检测有望成为一个新的评价精液质量和预测生育能力的指标，但对精子DNA损伤的病因、机制、预防及干预尚存在众多未解之谜，方法学上也有待于建立行之有效的临床标准体系，制定适合国人的检测标准值，在临床应用方面仍需继续深入研究。

致谢：本课题受北京市自然科学基金面上项目（7142158）资助

精子; DNA损伤; 受精

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（2014-03-03收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.07.017

R 321.1