内质网应激在帕金森病中的作用

吴 亮综述，张颖冬审校

帕金森病(PD)是仅次于阿尔茨海默病(AD)的年龄相关性神经变性病，主要的临床症状为运动迟缓、肌肉僵直、静止性震颤和姿势不稳;其神经变性特征为进行性黑质致密部(SNc)多巴胺能(DA)神经元变性、缺失、以及神经元内出现由α-共核蛋白(α-synuclein)组成的Lewy 小体的形成。虽然家族性PD 有一些基因突变基础，但大多数原发性PD 病因不明，有多种机制参与DA 神经元变性，包括线粒体功能障碍、氧化应激、细胞内Ca2+稳态失调等。最近研究表明，异常蛋白沉积导致的内质网应激在PD 的发病过程中也起到重要作用。本文就内质网应激在PD 发病与治疗中的作用作一综述。

1 内质网应激

1.1 内质网 内质网(endoplasmic reticulum，ER)是真核细胞重要的细胞器，它是由封闭的膜系统和围成的腔形成相互沟通的网状结构。内质网膜占细胞内膜结构的50%以上，整个内质网腔占细胞体积的10%以上。内质网是除核酸意外的重要生物大分子合成的基地，主要有以下功能:合成蛋白质信号肽;储存细胞内钙离子;合成脂质和胆固醇;释放正确折叠蛋白质。

1.2 内质网应激 内质网的蛋白折叠是在分子伴侣和折叠酶的帮助下完成的。内质网内极高浓度的蛋白质(100 mg/ml)使该细胞器非常容易导致蛋白沉积［1］。当细胞分化或者细胞生理条件的改变，可引起细胞内质网中蛋白量的增加。而在内质网蛋白负荷超过内质网的折叠能力时，就可导致内质网中异常蛋白质的沉积，从而引起内质网应激。相反，如果细胞要克服内质网应激，内质网蛋白负荷和折叠能力之间重新达到平衡。内质网应激时，一系列应激反应被激活，其中未折叠蛋白蛋白反应(UPR)是目前认识最为清楚的从内质网到细胞核的信号传导通路。UPR 可以提高细胞对内质网应激的适应性，并且使内质网重新达到稳态［2］。

2 UPR 主要的信号通路

内质网应激信号通过3 种UPR 跨膜蛋白传递信息，分别是双链RNA 激活蛋白激酶样内质网激酶(double stranded RNA-activated protein kinase-like ER kinase，PERK)、肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme-1，IRE1)及活化转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)。这3 中跨膜蛋白均与内质网分子伴侣BiP/GRP78 相结合，处于非活性状态。

2.1 分子伴侣BiP/GRP78 分子伴侣BiP/GRP78 是一种肽依赖性ATP 酶，属于热休克蛋白70 家族成员，能够快速与新生转移至内质网的蛋白相结合，尤其是与未发生糖基化、未折叠及未聚集的蛋白更容易结合。正常情况下，BiP/GRP78 与跨膜蛋白PERK、Ire1 和ATF6 结合，阻止下游信号通路的激活。随着内质网内未折叠蛋白的聚集，BiP/GRP78与PERK、Ire1 和ATF6 分离后和这些未折叠蛋白相结合，从而使这3 种信号通路激活。

2.2 蛋白激酶样内质网激酶(PERK)途径 PERK 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，激活后PERK 发生寡聚化和自身磷酸化，并将真核翻译起始因子-2 的α-亚基(eIf2α)51位的Ser 磷酸化，间接地使eIf2α 失活，抑制RNA 与核糖体的结合，这种保护性机制很快阻止了新生蛋白质向内质网腔的转移，抑制了内质网负荷的过重。但是，在eIf2 失活时，一些5’非翻译区包含有小的开放阅读框的mRNA 更容易被翻译。活化转录因子4(ATF4)就是其中之一，它的两个重要靶基因是转录因子C/EBP 同源蛋白(CHOP)和DNA 诱导损害34(GADD34)，CHOP 是控制凋亡过程中基因编码的转录因子。所以，PERK 途径既可以发挥细胞保护作用，也可以促使细胞凋亡，这种双重性发生在eIf2α 磷酸化水平。

2.3 肌醇需求酶1(IRE1)途径 Ire1 途径最保守，是唯一存在于低等胚胎细胞中的UPR 途径。Ire1 是一类I 型跨膜蛋白，不但具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，而且还有核酸内切酶活性。Ire1 有2 个基因，分别是Ire1α 和Ire1β。随着内质网应激的发生GRP78 失去了对Ire1α 的抑制，Ire1α的活性通过二聚体形成和转磷酸化作用被激活。激活的Ire1α 通过一种非传统的剪切机制将X 盒结合蛋白(XBP1)前体mRNA［pXBP1(u)］转化为成熟mRNA［pXBP1(s)］，之后XBP1(s)蛋白帮助将错误折叠蛋白反向从内质网转至胞液，从而减少内质网的负荷。而Ire1β 特异性的位于胃肠道的上皮细胞的ERS 反应中起着相应的作用。

2.4 活化转录因子6(ATF6)途径 ATF6 是一个最初合成作为内质网跨膜蛋白的转录因子，具有较大的ER 腔部分。当BiP/GRP78 从其N 端释放后，ATF6 通过囊泡从内质网转移至高尔基体。在高尔基体内ATF6 经过位点1 蛋白酶(S1P)和位点2 蛋白酶(S2P)被切割形成p ATF6(N)，p ATF6(N)转位进入细胞核内，与ERS 反应原件结合，从而激活ER分子伴侣BiP/GRP78、GRP94 等的表达来缓解内质网压力。

3 内质网应激与凋亡

内质网应激的持续存在可以导致凋亡信号通路的激活，其中主要有CHOP 导致的凋亡途径、Ire1α 通路导致的凋亡途径和caspase-12 途径。

3.1 CHOP 导致的凋亡途径 在糖尿病、PD 等许多疾病模型中，采用基因敲除小鼠已经证实CHOP 在内质网应激导致的细胞凋亡中的作用。但是其中机制尚不清楚。目前多认为，CHOP 是通过抑制抗凋亡因子Bcl-2 水平导致细胞凋亡的。Mccullough 等研究发现，在CHOP 过表达的细胞中，内质网应激所致细胞凋亡增加，同时Bcl-2 降低、ROS 增加。恢复Bcl-2 表达水平后，ROS 水平降低，凋亡减少，其中机制可能是CHOP 抑制Bcl-2 启动子有关［3］。因此，可以看出CHOP 的核内转移是其导致细胞的凋亡的必要步骤。Chiribau CB 等研究发现，CCAAT 结合增强蛋白β(CCAATbinding enhancer protein β，C/EBPβ)的亚基LIP(liver inhibitory protein)能够结合CHOP，协助其向核内转移，进而抑制Bcl-2 表达，促进细胞凋亡。在心肌肥大小鼠模型中，同样发现对照组及CHOP 基因敲除小鼠心肌细胞凋亡增加，Bcl-2/Bax 比例降低［4］。Bcl-2 能够阻断BH3-only 蛋白(Bad、Bim、Noxa、Puma)介导的线粒体通透性增加，抑制细胞凋亡。另一理论认为，氧化应激是CHOP 导致细胞的根本原因。持续存在的内质网应激不仅能使内质网腔内处于高度氧化状态，而且诱导胞浆内产生ROS。CHOP 调控的内质网氧化酶1α(ER oxidase 1 α，ERO1α)是介导内质网处于氧化重要靶点。在2 型糖尿病小鼠模型中，基因敲除CHOP 能够有效抑制β细胞凋亡，这种保护作用与降低ERO1α、抑制氧化应激有关。最近研究表明，CHOP 能够诱导ERO1α 激活内质网Ca2+释放通道三磷酸肌醇受体IP3R，调节胞浆内Ca2+浓度，进而控制细胞存活［5］。此外，内质网应激的持续存在，导致的eIf2α磷酸化能够减少细胞内蛋白合成，减少氧化应激和凋亡。GADD34 可以促进p-eIf2α 去磷酸化，使上述蛋白抑制作用减弱，而CHOP 正是GADD34 的调节蛋白之一。然而，CHOP并不是总是诱导细胞凋亡的。研究发现，在原代神经元缺氧模型中，敲除CHOP 基因后增加细胞对缺氧和内质网应激的敏感性，并降低脑源性神经营养因子的保护作用，而细胞缺氧前CHOP 过表达能够有效保护细胞的缺氧损伤［6］。这说明CHOP 在某些条件下可能作为一种适应性蛋白，抵抗细胞损害。另外，由于UPR 的复杂性，在缺氧状态下，拮抗细胞凋亡的因素抵消细胞凋亡的因素时，尽管CHOP 表达增加，也可能并不表现出细胞损害。

3.2 Ire1 通路导致的凋亡途径 内质网应激发生时，Ire1α 激活后，通过XBP1(S)能够帮助错误折叠蛋白反向从内质网转至胞液，从而减少内质网的负荷，从而抑制细胞凋亡。但是，激活的Ire1 同时能够与肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumour necrosis factor receptor associated factor 2，TRAF2)结合，进而激活凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)，最终导致JNK 的激活，促进细胞凋亡。内质网应激激活剂毒胡萝卜素或者衣霉素处理的PC12 细胞中可见内源性ASK1、JNK 激活，而且只有在TRAF2 存在的条件下，Ire1 才能ASK1 与结合，这说明内质网应激时，内质网膜上形成Ire1-TRAF2-ASK1 复合体，进而激活ASK1-JNK 通路。Klee 等通过构建内质网表达Bak 的细胞系，发现Bim 和Puma 能选择性地激活Ire1-TRAF2 通路，并没有对下游的XBP-1 通路没有影响［7］。但是，在正常细胞中，不同应激状态下Ire1 下游信号通路变化方向并不清楚，如何调节Ire1 下游信号通路控制细胞的存活需要更深入的研究。

3.3 Caspase-12 信号通路 Caspase-12 是内质网应激特有的细胞凋亡蛋白酶，它可以激活caspase-9，进而激活caspase-3，从而导致细胞凋亡。已经证实，caspase-12 存在于毒胡萝卜素作用的神经细胞内质网胞浆侧。caspase-12 基因敲除的小鼠能够部分抑制内质网应激所致的细胞凋亡。这说明caspase-12 是内质网应激诱导细胞凋亡所必需的细胞凋亡蛋白酶。分化的PC12 细胞受到毒胡萝卜素作用后，钙蛋白酶2 和caspase-3/7 能够激活caspase-12，活化的caspase-12 再通过caspase-9，进一步激活caspase-3，导致细胞的凋亡。也有研究认为，在正常状态下，TRAF2 与caspase-12 前体可形成稳定的复合体，内质网应激发生时，TRAF2 能够使caspase-12 前体剪切为活化的caspase-12。但是，UPR 的各信号通路如何影响caspase-12 激活和凋亡的尚不清楚。随着研究的深入，人们发现caspase-12 并不存在于人类细胞中。在SK-N-SH 和Hela 细胞中，caspase-4 在内质网应激时能够被激活，发挥类似caspase-12 功能［8］。

4 内质网应激与PD

大量研究表明，内质网应激与帕金森病密切相关。2007年，Hoozemans 等首次在PD 患者中脑黒质区发现UPR 的激活，PERK 和eIF2α 免疫反应呈阳性，并且活化的PERK 存在于α-共核蛋白沉积的神经元中［9］。随着研究的进展，人们逐渐认识到内质网应激在PD 发病中可能起到至关重要的作用。

4.1 内质网应激在α-共核蛋白突变型PD 模型中的作用 α-共核蛋白是由SNCA 基因编码的蛋白，SNCA 基因突变与家族型PD 密切相关。A53T 突变型α-共核蛋白表达的细胞中，内质网应激相关蛋白GRP78、p-eIF2α 表达增加，同时敲除caspase-12 基因后，细胞凋亡减少［10］。这说明SNCA基因突变细胞凋亡与内质网应激有关。Jiang 等研究发现，内质网应激的增加也能相应地加剧α-共核蛋白的聚集［10］。可以看出，内质网应激和α-共核蛋白聚集之间存在相互促进的关系。Colla 等研究发现，在α-共核蛋白A53T 突变型小鼠脑组织中，α-共核蛋白聚集在内质网内形成有细胞毒性的低聚合体［11］。α-共核蛋白聚集发生在症状发生之前，α-共核蛋白不断聚集导致疾病不断进展。内质网应激拮抗剂salubrinal能够有效延缓动物症状加剧，降低内质网内α-共核蛋白聚集［11］。同样在α-共核蛋白转基因小鼠中，GRP78 表达增加，增加的GRP78 可以同α-共核蛋白结合，导致激活PERK 通路［12］。因此，可以认为内质网是α-共核蛋白聚集的发生地，α-共核蛋白与分子伴侣结合，引发UPR，持续的内质网应激存在引起细胞凋亡。另一研究认为，α-共核蛋白A53T 突变型细胞内质网应激的发生可能与α-共核蛋白聚集抑制内质网与高尔基体之间蛋白转运有关。当促进内质网与高尔基体之间蛋白转运的基因Ypt1p/Rab1 表达增加时，α-共核蛋白的毒性作用降低，反之，则增加。在Rab1 和α-共核蛋白双表达多巴胺能细胞中，Rab1 能够使多巴胺能神经元凋亡减少［13］。同时研究还发现，α-共核蛋白基因的突变，可使内质网Ca2+通道调节受损，导致内质网内Ca2+平衡破坏，亦可以诱发内质网应激［14］。由此可见，α-共核蛋白导致内质网功能受损可能是PD 主要发病机制。

4.2 内质网应激在毒素诱导的PD 模型中的作用 在MPTP、6-OHDA 及鱼藤酮诱导的PD 模型中，PERK 及Ire1α通路被激活［15］，且通过基因水平调节这些通路，可以对DA能神经元的存活产生影响。并且发现，这些神经毒素造成线粒体功能失调和氧化应激可能是导致内质网应激的根本原因。但是，Uehara 等［16］发现，在PD 患者及PD 细胞模型中存在内质网折叠酶(protein disulfide isomerase，PDI)的S-亚硝基化，导致PDI 的活性受到抑制，导致多聚泛素化蛋白聚集，激活内质网应激。而另一研究［17］发现，ROS 并不参与鱼藤酮诱导的SK-N-MC 早期细胞死亡，可能内质网应激在其中起到更大的作用。因此，内质网应激可能在PD 的DA 能神经元早期死亡中起到更重要的作用，早期干预内质网应激可能PD 治疗和预防具有重要意义。

5 内质网应激在PD 治疗中的作用

内质网应激在PD 的发病起到至关重要的作用，针对内质网应激的治疗策略也在研究与开发中。

5.1 干预内质网应激的化学制剂 目前已发现大约20余种化学制剂能够缓解内质网应激、改善内质网功能、维持细胞活性。Kraskiewicz 等［18］将其分为5 大类型:(1)直接干预内质网应激信号通路的药物:如salubrinal、BIX、水杨醛亚胺类似物、黄酮类、胍那苄、STF083010 等;(2)化学分子伴侣:PBA、TUDCA、TMAO 等;(3)蛋白降解抑制剂:Eeyarestatin、MG132、硼替佐米等;(4)抗氧化类:依达拉奉、DBM 衍生物、NAC 等;(5)影响Ca2+通路的药物:丹曲林、咔唑类衍生物等。salubrinal 是最常用的干预内质网应激的制剂。研究发现，salubrinal 能够有效保护衣霉素介导内质网应激对PC12 细胞的损伤，能够阻断p-eIf2α 的去磷酸化，维持其磷酸化状态，从而抑制胞内蛋白合成，减轻内质网负荷，降低细胞凋亡。在α-共核蛋白A53T 突变型细胞中，salubrinal 能够有效减少细胞凋亡［19］。在α-共核蛋白过表达的PD 大鼠模型中，salubrinal 不仅能够延缓动物PD 症状的发生，改善运动功能，而且能够减少α-共核蛋白在内质网内的聚集［11］。但是该研究发现salubrinal 对多巴胺能神经元的并不具有保护作用［11］。最近研究发现，salubrinal 能够减少β-淀粉样蛋白导致的神经元的死亡，不过该研究认为salubrinal 发挥保护作用并不是由于抑制了内质网应激，而是抑制了NF-κB 通路。由此可见，对于salubrinal 对神经元的作用可能与其损伤形成不同有关。依达拉奉是强力地自由基清除剂，具有抗氧化作用。最早在小鼠脑组织缺血缺氧模型中，发现依达拉奉不仅能够减少脑梗死面积、改善神经缺损症状，而且能够抑制p-eIF2α 和CHOP 表达，减少caspase-12 的激活。在衣霉素诱导的神经胶质细胞中，依达拉奉能够抑制GRP78 及XBP-1 的水平。这说明依达拉奉能够有效保护内质网应激所致的细胞凋亡。在鱼藤酮诱导的PD 大鼠模型中，依达拉奉能够保护大鼠中脑黒质多巴胺能神经元，改善运动症状［20］。在神经退行性疾病中，小分子的化学分子伴侣常被用于减弱内质网应激。在α-共核蛋白转基因小鼠中，4-苯基丁酸(4-PBA)能够改善动物运动症状，同时多巴胺能神经元死亡减少［21］。同样地，另一种分子伴侣牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)能够保护MPTP 诱导的多巴胺能神经元损伤［22］。丹曲林是一种Ca2+内质网释放通道兰尼碱受体抑制剂，临床上常用于治疗上运动神经元损伤造成的痉挛性肌张力增高。在短暂大脑中动脉闭塞大鼠模型中，丹曲林能够有效抑制内质网应激，降低p-PERK、p-eIF2α 和CHOP 的表达水平，同时有效保护缺血半暗带区的细胞。在四氢生物蝶呤(BH4)诱导的多巴胺能神经元损伤模型中，丹曲林能减少BH4 对细胞的毒性作用，这说明丹曲林可能PD 多巴胺能神经元凋亡有治疗作用［23］。总之，上述干预内质网应激的化学制剂能够有效保护多巴胺能神经元，但是其中机制尚不清楚。PD 等神经退行性疾病的发生与进展可能是内质网应激、氧化应激、炎症等多种因素共同导致的结果，并且各种因素之间可能相互影响，所以，关于干预内质网应激的各种制剂对保护神经细胞机制仍需要更深入的探讨。另外一个重要问题是，一些化学制剂可能针对UPR 通路的某特定蛋白进行阻断，但是对其余通路上蛋白表达的影响如何，也需要进一步研究。

5.2 基因治疗 基因治疗是正在探索中的较有前景的新疗法，用病毒载体进行基因转移，从而在脑的特定区域通过特异性蛋白质表达来治疗PD。将激活形成XBP1s 蛋白通过立体定位注射于小鼠纹状体，可以有效保护MPTP 诱导的多巴胺能神经元损伤。另外一项研究同时将表达α-共核蛋白和GRP78 的腺病毒注入大鼠黒质区，发现GRP78 的过表达能够减少α-共核蛋白大鼠模型中多巴胺能神经元的死亡、改善动物运动功能，这可能与GRP78 减轻内质网应激有关。这两项研究为通过基因干预UPR 治疗PD 奠定了基础。随着PD 基因治疗的不断进步，UPR 通路中的基因将得到更大的利用。

6 总结

内质网应激信号通过UPR 跨膜蛋白传递信息调节细胞的存活。在PD 的早期阶段，内质网应激能够有效保护多巴胺能细胞。但是持续的内质网应激的存在，能够激活下游因子导致细胞死亡。通过调节UPR，控制内质网应激对多巴胺能神经元造成的损害，或能为治疗PD 的新的方法。

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