神经干细胞动脉移植治疗脊髓损伤后Bcl-2 与Bax 的变化

金 华，赵 强，张昆林，肖高鹏，李俞锦，李艳华

脊髓缺血损伤(SCII)是一种危害严重的脊柱外科疾病，它可以导致损伤平面以下神经功能丧失并严重影响身体多个系统功能，致残、致死率较高［1］。脊髓缺血可导致脊髓神经元和胶质细胞缺血缺氧、发生中心性缺血坏死［2］。此外，脊髓缺血再灌注还能诱发自由基释放、局部炎症、电解质紊乱，导致微循环障碍，加重细胞缺血缺氧，形成恶性循环，造成损伤进一步扩大，最终导致脊髓结构和功能严重障碍［3］。SCII 目前尚无有效治疗手段，大多数研究集中于干细胞移植治疗脊髓损伤。

NSCs 是一种具有分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞能力并能自我更新的多潜能细胞［4］。研究表明，NSCs 治疗脊髓损伤的机制为［5］:(1)神经干细胞通过分化补充外伤后缺失的神经元和胶质细胞;(2)神经元和神经胶质细胞分泌多种神经营养因子，改善局部微环境并启动与脊髓再生相关基因的顺序表达，促进损伤轴突再生;(3)产生多种细胞外基质，填充脊髓损伤后遗留的空腔，为再生的轴突提供支持物;(4)使残存脱髓鞘的神经纤维和新生的神经纤维形成新的髓鞘，保持神经纤维功能的完整性。

目前NSCs 的移植主要途径有3 种［6］:局部注射移植、经脑脊液注射移植和经血液循环注射移植。动脉移植可减少干细胞在血液循环中的损失，提高干细胞的利用率。有报道采用颈内动脉穿刺方法移植干细胞治疗脑损伤［7］，但关于经动脉移植干细胞治疗脊髓损伤的研究尚未见报道。本研究通过结扎肾下腹主动脉建立脊髓缺血再灌注损伤模型，经股动脉输注NSCs，观察大鼠神经行为学变化，Tunel 染色观察缺血脊髓细胞凋亡情况并以RT-PCR 和Western blot 检测Bcl-2、Bax 表达变化。以期推测动脉移植NSCs 在治疗脊髓缺血损伤中的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料 孕14 d 的SD 胎鼠5 只，用于神经干细胞培养。清洁级健康成年雌性SD 大鼠54 只，体重(220±10)g，随机分为NSC 组、对照组和假手术组各18 只。对照组行肾下腹主动脉结扎术和椎动脉切断术但不移植NSCs，阻断血供120 min 后再灌注;NSC 组行肾下腹主动脉结扎术和椎动脉切断术并移植NSCs;Sham 组仅手术不结扎。每组取5只动物分别于术后5 d、10 d、15 d 行BBB 评分和运动诱发电位检测，余下每组13 只大鼠于术后7 d 取材，其中8 只动物用于RT-PCR 和Western blot 检测，5 只动物用于Tunnel 染色。实验动物由昆明医学院实验动物科提供［实验动物质量合格证号:SYXK(滇)2005-0004］。

1.2 方法

1.2.1 胎鼠神经干细胞的分离培养和鉴定无菌条件下取SD 孕鼠的胚胎，分离脑膜获取海马，制成1 mm3组织块，加入含DMEM/F12 1∶1 培养基、20 ng/mlbFGF、2 mmol/L 谷氨酰胺、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml 链霉素的2%B27 神经干培养基，调整细胞浓度(1.5～2.5)×105个细胞/ml，接种于6 孔培养板，置37 ℃5%CO2培养箱培养，每3～4 d 半量换液。此后每7 d 传代一次。取少量第2代神经干细胞，用常规ABC 免疫细胞染色法进行兔抗Nestin 抗体染色鉴定，Nestin 阳性细胞为神经干细胞。体内存活:培养及鉴定方法同前，移植前对上述培养细胞进行hochest33342 标记。具体方法为:避光条件下配置hochest 工作液(1∶1000)，将其加入NSC 6 孔板内，没孔20 μl，避光孵育1 h。

1.2.2 缺血再灌注及NSCs 移植动物模型制备 以3.6%的水合氯醛(1 ml/100 g)腹腔注射麻醉动物，取右侧卧位固定大鼠，纵行切开左侧腹部皮肤2～3 cm，钝性分离皮下组织，暴露后腹膜。游离左肾动脉及其上、下各约1.5 cm 长的腹主动脉，注意保护淋巴管。以双极电凝(威利FxTM-8C 型电刀，美国)切断左肾上动脉分支以上腹主动脉向脊髓发出的椎动脉，随后于左肾动脉开口下方以4 号丝线结扎腹主动脉，阻断血供。阻断时，以股动脉压力波形消失MAP≤10 mmHg(1.33 kPa)为准;开放时，以股动脉压力波形恢复为准。动脉结扎前经股动脉推注肝素20 U 预防血栓形成。NSCs 移植组于肾下腹主动脉开放后10 min，向股动脉留置针内缓慢推注NSCs 100 万个(0.5 ml)，5 min 内注射完毕。术毕认真检查手术部位没有渗血后逐层缝合。术后所有大鼠每天腹腔注射青霉素(20 万U)预防感染，对于术后截瘫的动物，每天早晚各一次按摩膀胱排尿，必要时给予开塞露排便。

1.3 神经行为学评价 采用Basso 等［8］提出的BBB 评分体系于术后0 d、5 d、10 d 和15 d 对所有大鼠进行行为学评估，包括0～21 级，完全功能缺失为0 分，完全正常鼠为21 分，评价的内容主要包括大鼠后肢的运动、躯干位置及稳定性、步态、协调性、爪的置放、足趾间隙以及尾的位置等。评分者为3 位熟悉评分标准的非本组实验人员，评分后取平均值。

1.4 运动诱发电位(motor evoked potential，MEP)术后10 d 采用TMS 刺激仪(丹麦，DANTEC)对所有实验动物行运动诱发电位的检测。将大鼠仰卧位固定，记录电极置于一侧腓肠肌，地线置于耳朵。以50%的磁刺激量单次刺激大脑皮质运动区，采用信号采集系统(丹麦，Medtronic，KEYPOINT)，采样率为20 kHz，使用500 Hz 低通和1 Hz高速滤波记录波形，并显示于荧光屏上，重复刺激3～5 次，将磁刺激后有可重复性的波存于电脑，并标记潜伏期和波幅。

1.5 原位细胞凋亡检测(Tunnel 染色)于术后7 d 麻醉动物，每组各5 只，开胸暴露心脏，左心室穿刺并经升主动脉用生理盐水快速灌注后，用4%多聚甲醛缓冲液由快到慢灌注固定，截取L2 脊髓节段于4%多聚甲醛缓冲液内后固定6 h 以上，脱水、石蜡包埋并连续冰冻切片(5 μm)。组织切片脱蜡，滴加2 μg/ml 蛋白酶K，37 ℃消化30 min，0.01 mol PBS 漂洗3 次，阳性对照加入DNAse I，室温孵育10 min。0.1%DEPC 水浸泡30 min 后PBS 漂洗3 次。甩去切片上多余液体，按照1∶9 比例配制凋亡试剂盒1 液和2 液，每张切片滴加适量该混合液(冰上操作);阴性对照组只加入试剂2 液，而不加1液。将切片置于湿盒中，37 ℃标记1 h，4 ℃过夜。PBS 漂洗3 次，3%H2O2-甲醇室温孵育15 min，PBS洗涤3 次。滴加5%牛血清白蛋白封闭液50 μl，37 ℃30 min，甩掉封闭液直接滴加转化剂-POD(辣根过氧化物酶)50 μl，37 ℃孵育40 min，PBS 漂洗3次。DAB 显色，单蒸水终止显色后流水冲洗10 min(冲净附着在标本上的DAB 显色液颗粒)。苏木素轻度复染。常规脱水、透明、封片、镜下观察。

1.6 RT-PCR 检测 于术后7 d 对各组8 只大鼠取材。动物麻醉后俯卧固定，后正中切口暴露脊髓损伤并截取L2 脊髓组织，沿后正中沟将其分为左右两部分，取左侧用于RT-PCR 检测，DEPC 处理水漂洗标本后迅速置于液氮或-80 ℃冰箱保存。引物设计采用Primer premier 5.0 软件，由大连宝生物公司制备上、下游引物。以Trozol 法分别提取总RNA，并逆转录为cDNA。自行设计大鼠内参β-actin 和Bax、Bcl-2 的引物序列。β-actin 引物上游序列为:5’-TGTGCTGTCCCTGTACGCCTCT-3’，下游序列为5’-GCACTGCACATTGCGTTTAT-3’，扩增产物227 bp，退火温度52.5 ℃。Bax 引物上游序列为:5’-GTTTCATCCAGGATCGAGCAGA-3’，下游序列为5’-GGAGTCCGTGTCCACGTCAG-3’，扩增产物176 bp，退火温度56.0 ℃。Bcl-2 引物上游序列为:5’-CCCCTGGCATCTTCTCCTTCC-3’，下游序列为5’-CATCCCAGCCTCCGTTATCC-3’，扩增产物448 bp，退火温度58.0 ℃。引物由大连宝生物工程公司合成。反应总体积25 μl;进行PCR 扩增，反应条件为:94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s，退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环后72 ℃延伸5 min。得到产物后用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析，在凝胶成像系统上观察电泳条带及其位置，并与Marker比较扩增产物的大小并采用ImageJ 软件对电泳条带进行密度分析，计算β-actin 和Bax、Bcl-2 的相对光密度值。

1.7 Western blot 检测 与RT-PCR 共用动物，截取L2 节段右侧脊髓组织研磨至粉末状，加入预冷的蛋白裂解液，搅拌均匀，冰上静置30 min，随后4 ℃离心(12000 r/min)30 min，取上清液。采用紫外分光光度计进行蛋白质定量，按总蛋白50 μg计算上样体积，以4∶1 的比例加入上样缓冲液煮沸变性10 min;12%SDS-PAGE 60 V 垂直电流，当样品达到分离胶后上调电压至100 V，溴酚蓝达到分离胶底部后电泳结束。采用湿转电转移仪(Bio-Rad公司)转膜。转膜结束后，室温下用含5%脱脂奶粉的PBS 封闭1 h，后加入第一抗体工作液(Santa Cruz公司，工作液浓度1∶1000)室温下震荡0.5 h，4 ℃过夜，PBS 清洗3 次，再加入1∶5000 稀释的二抗(Santa Cruz 公司，工作液浓度1∶2000)室温下孵育1 h，PBS 清洗3 次，除去未结合的抗体。采用Bio-Rad 公司的凝胶成像仪采集图片，并测其灰度值，除以相应的β-actin 表示其蛋白含量。

2 结果

2.1 神经行为学评分(BBB 评分)与假手术组比较，对照组和NSC 组术后各时间点BBB 评分显著降低(P＜0.01);SCII 大鼠后肢功能存在自发性恢复，对照组和NSC 组BBB 评分较同组前一时间点均明显增加(P＜0.05);NSC 组评分于术后10 d 和15 d 高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 运动诱发电位(motor evoked potential，MEP)SCII 术后1 d 对照组和NSC 组未能引出MEP，波形近似直线;术后10 d，3 组均能测到MEP，对照组和NSC 组MEP 波幅较假手术组显著减少(P＜0.01)，而潜伏期显著延长(P＜0.01)，其中NSC组波幅大于对照组(P＜0.05)，潜伏期短于对照组(P＜0.05)。

2.3 Tunnel 染色结果 SCII 术后7 d，假手术组脊髓内无TUNEL 阳性产物，对照组和NSC 组均可见大量细胞核被染为蓝紫色的凋亡细胞，细胞形态不一，细胞核固缩，有的呈碎片状，大小不一致，核内散在分布蓝紫色颗粒，部分呈月牙状或花瓣状紧贴核膜，核膜完整或不完整，并可见凋亡小体分布。与对照组比较，NSC 组细胞凋亡数明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.4 Bax 和Bcl-2 mRNA 表达水平 与假手术组比较，SCII 损伤后7 d Bax 和Bcl-2 mRNA 表达水平均明显增加(P＜0.05)，其中NSC 组Bax mRNA表达水平低于对照组(P＜0.05)，而两组间Bcl-2 mRNA 表达变化无统计学差异(P＞0.05);NSC 组Bcl-2/Bax 比值较对照组上调，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.5 Western blot 检测 与假手术组比较，SCII损伤后7 d Bax 和Bcl-2 蛋白表达水平均明显增加(P＜0.05)，其中NSC 组Bax 蛋白表达水平低于对照组(P＜0.05)，Bcl-2 蛋白表达水平高于对照组(P＜0.05);NSC 组Bcl-2/Bax 比值较对照组上调，差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

行为学功能评价是判断脊髓损伤后功能变化、功能自然恢复程度以及干预治疗效果的有效手段［9］。BBB 评分系统是目前认可度最高、应用最广泛的脊髓损伤评价办法，可作为大鼠脊髓损伤后运动功能恢复的标准评分方案［10］。MEP 检测是评估动物运动功能的客观方法，能够间接反映该动物脊髓功能状况［11］。研究中，NSC 组和对照组组大鼠手术当天BBB 评分明显低于假手术组，且于术后1 d均未测到MEP 波形，提示实验中缺血模型能够阻断动物腰段脊髓供血造成后肢功能明显缺失。随着时间延长，两组动物BBB 评分和MEP 均存在不同程度的改善。于术后10 d，NSC 组BBB 评分优于对照组(P＜0.05)，且MEP 波幅和潜伏期均存在显著提高(P＜0.05)，提示经股动脉输注NSC 促进了脊髓缺血损伤大鼠后肢运动功能恢复。

术后7 d，细胞凋亡可能是SCI 后继发损伤期的重要病理变化［12］。细胞发生凋亡时，基因组DNA会断裂成许多DNA 片段，这些DNA 链断端缺口可以利用酶标记核苷酸3’末端以便识别。Tunel 染色就是利用了末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidy1 transferase，TdT)将标记有荧光素的ddUTP 转移到片段的3’-OH 游离末端，以此标记DNA 链断端缺口［13］。本实验中，对3 组大鼠L2 脊髓进行Tunel 染色发现NSC 组与对照组均存在细胞大量凋亡，其中NSC 组凋亡细胞计数较对照组显著减少(P＜0.05)，提示NSC 移植能抑制缺血再灌注损伤脊髓细胞凋亡。

神经细胞凋亡的分子机制主要是细胞表面接触到了诱导刺激因子，后将信号传入细胞内部，通过启动其内部大量的凋亡相关基因的表达，形成由基因调控的细胞主动死亡过程［14］。这些基因通常分为促凋亡因子和抗凋亡因子，它们相互作用，共同调控细胞的存活。其中，Bcl-2 和Bax 是相互拮抗的2 个基因，Bcl-2 基因是一种重要的抗凋亡因子［15］，而Bax 基因在促凋亡中发挥重要作用。Bcl-2 基因是从滤泡性淋巴瘤和白血病中分离出来的一种原癌基因，存在于线粒体、核膜和内质网中［15］。Bcl-2 可抑制细胞色素C 自线粒体释放至胞质，从而阻止细胞色素C 对caspase 蛋白酶的激活，抑制细胞凋亡［16］。Bax 蛋白是Bcl-2 的同源蛋白，21%的氨基酸与Bcl-2 同源，但是Bax 能与线粒体膜通道结合促进心肌细胞色素C 的释放从而促进细胞凋亡。因而有人认为细胞在受到凋亡刺激后的生存能力由Bcl-2 与Bax 的比率决定［17］，Bcl-2 表达水平较高时，比率上调，可形成Bcl-2/Bax 的异二聚体，抑制细胞凋亡;Bax 表达水平较高时，比率下调，可形成Bax/Bax 同二聚体，导致细胞凋亡。本研究中，术后7 d，NSC 组和对照组Bcl-2 和Bax mRNA 和蛋白水平较假手术组显著增加(P＜0.05)，提示SCII 调动了凋亡因子Bcl-2 和Bax 的表达，参与调控损伤脊髓细胞的存亡命运。与对照组比较，NSC 组Bax mRNA 和蛋白水平减少(P＜0.05)，而Bcl-2 蛋白水平增加(P＜0.05)，因此导致Bcl-2/Bax 比值上调。这说明与对照组相比，NSC 移植可能改变缺血损伤脊髓凋亡调控机制，使抗凋亡作用强于促凋亡作用。

结合上述结果可见，脊髓缺血损伤可以导致大鼠后肢功能缺失，经股动脉输注NSC 可以实现向缺血损伤脊髓移植干细胞的目的。移植NSC 在损伤脊髓，可以通过上调Bcl-2 表达和下调Bax 表达改变局部细胞缺血损伤的继发凋亡反应的发生，从而促进动物后肢运动功能的恢复。因此，经股动脉移植NSC 可能成为治疗脊髓损伤的有效移植途径并进而得到推广。

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