维生素E型微胶团饲料对刺参生长免疫及水质的影响研究

■汪 将 徐永平,2 金礼吉,2 李晓宇 王熙涛 李建光 车 健

（1.大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁大连 116024；2.教育部动物性食品安全保障中心，辽宁大连 116024）

刺参已经成为中国发展最快的海水养殖品种，有限的天然饵料已不能满足快速发展的刺参养殖业的需求，因此，投喂人工饲料成为必然趋势[1]。由于刺参的摄食特点[2]及刺参人工饲料生产工艺的滞后，不仅造成刺参饲料的极大浪费，还严重影响水体环境，导致水中氨氮、亚硝酸盐的含量升高，进而导致刺参生长速度下降，易发生病害[3-6]。本文通过微切变助互作技术生产一种微胶团饲料，考察微胶团颗粒饲料对刺参养殖水体中氨氮、亚硝酸盐水平的影响，同时考察在微胶团饲料中添加维生素E对刺参生长、免疫的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

仪器：高效液相色谱（安捷伦1100，美国）；高速低温离心机（Eppendorf 5804 R,德国）。

药品和试剂：维生素E标准品（Sigma，美国），溶菌酶、酸性磷酸酶试剂盒（南京建成），其他试剂均为国产分析纯。

1.2 实验动物

实验所用刺参购于大连鹤盛丰水产养殖场，初始体重(7.96±0.01)g。正式实验前刺参暂养7 d，每天投喂海藻粉2次。

1.3 饵料制备

饲料组成见表1，饲料原料：鱼粉、海泥、海藻粉、大豆粉、小麦淀粉、贝壳粉均购于鹤盛丰水产养殖场（大连，中国）。维生素E醋酸酯（dl-α-tocopheryl酯）和维生素混合物（不含维生素E）购于HUYU生物技术公司（上海，中国），矿物质混合物由SEM饲料公司提供（大连，中国）。

表1 饵料的基本组成（干重%）*

饲料生产工艺参照王黎[7]的方法略有修改：首先将原料在室温下进行干燥（含水量≤15%），按比例称取藻粉、鱼粉、海泥、贝壳粉混匀进行粗粉碎（粒度250 μm）；向粗粉中加入淀粉、复合维生素和矿物质混合均匀制成普通粉状饲料；向普通粉状饲料中加入不同水平的维生素E醋酸酯，使用α-纤维素将各组重量补齐；将部分粉状饲料利用微切变助互作技术（专利号：ZL200510130852）在常温下加工成超微粉饲料（粒度38 μm），将超微粉与纯净水按1∶1（W/W）比例混合成胶团状，用压片机压成片状，室温条件下风干；最后用粉碎机破碎，筛分得到80～100目的微胶团饲料(粒度150～185 μm)。其中饲料中维生素E的添加量分别为0、50、100、200、500、1 000 mg/kg，其实际含量采用高效液相色谱法（HPLC）进行测定，测定方法参照王安群等[8]，分析结果见表2。

表2 实验饲料中维生素E含量的分析

1.4 实验分组及养殖管理

将实验刺参饲养于塑料水槽中（38 cm×54 cm×80 cm），实验期间连续供氧，保证溶氧不低于5 mg/l；水温维持在（15±1）℃，pH值为8.0±0.1，盐度为30‰～32‰，每4 d换1次水。

将刺参随机分配到21个水槽中，每个水槽15头，共设7个实验组每组，设3个重复，分别投喂普通粉状饲料，E0～E1000组微胶团饲料。实验时间60 d，实验的第2、3、4 d测定各组水体中的氨氮、亚硝酸盐含量；实验结束后各组刺参计数、称重，用于生长、免疫指标的测定。

1.5 水质指标分析

水体中氨氮含量的测定采用纳氏试剂法[9]；水体中亚硝酸盐含量的测定参照袁广旺等[10]的方法。

1.6 生长指标

特定生长率（Specific Growth Rate，SGR），计算公式如下：

式中：Wt是终体重；Wi为初体重；t为实验时间（d）。

1.7 细胞免疫

从每个平行实验组中随机取15头刺参置于冰上，用剪刀沿背部剪开，采集体腔液，并立即进行细胞免疫指标的测定，余下的体腔液使用低温冷冻离心机在4℃，3 000 g离心10 min后取上清液，分装于1.5 ml离心管中（每管0.5 ml），冻存于-70℃用于体液免疫指标的检测。

体腔细胞计数参照Barracco等[11]方法并略作修改：取500 μl刚采集的体腔液于灭菌的1.5 ml离心管中，加入等体积的1.5 mg/ml的EDTA-Na2抗凝处理，混匀后取10 μl加入血球计数板计数（×400），每个细胞样计数3次。

细胞超氧阴离子（O2-）测定参照孙永欣[12]方法，首先将分离得到的体腔细胞用细胞培养液（含有5%胎牛血清和0.5%抗生素的经0.22 μm滤膜过滤灭菌海水）调至5×106个/ml，取0.5 ml稀释后体细胞液与等体积的氮蓝四唑（NBT）溶液（含有0.2%NBT的细胞培养液），11 μl佛波酯溶液（PMA,1 μM）和89 μl细胞培养液于1.5 ml无菌离心管中置室温下孵育1 h，常温离心（540 × g，10 min），弃上清，余下细胞加入1 ml 70%的乙醇重复清洗2次后离心弃上清，所得物质用600 μl KOH（2 M）和700 μl二甲基亚砜（DMSO）溶解，于625 nm下进行吸光度测定。

1.8 免疫酶活性

溶菌酶、酸性磷酸酶活性使用试剂盒测定：溶菌酶酶活定义为每分钟吸光度减少0.001为一个酶活单位；酸性磷酸酶（ACP）酶活定义为37 °C时，100 ml血清30 min内产生1 mg对硝基酚为1个酶活单位。

1.9 数据处理

各实验组数据均以均值±标准误（mean±SE）表示。所有数据使用SPSS 18.0软件进行统计学分析。采用单因素方差分析，不同处理之间采用Ducan's多重比较，当P＜0.05认为差异显著。

2 结果与讨论

2.1 水质指标分析

粉状饲料投喂后水体浑浊度高，大约3 h后沉入水底；而微胶团饲料水体澄清，大约5～10 min后沉入水底。由于刺参为地栖生物，行动缓慢，饲料更快的沉入水底能减少溶失并且便于刺参采食。投喂粉状饲料和微胶团饲料水中氨氮的含量4 d内的变化见图1。从图1中可以看出在第2、3 d时，投喂粉状饲料的水体中氨氮的浓度迅速上升，第4 d氨氮的浓度则变化不大。而投喂微胶团饲料的水体在第2、3 d时氨氮的浓度变化不大，但第4 d上升较快。通过比较发现，投喂粉状饲料的水体中氨氮的含量大约为投喂微胶团饲料的两倍。

图1 在4 d内投喂不同饲料水体中氨氮含量的变化

对于刺参的室内育苗和养殖来说，影响最大的水质因子是氨氮和亚硝酸盐[13]，长期处于过高的氨氮和亚硝酸盐会影响刺参的生长代谢[4]，降低刺参的免疫水平[5-6]，因此本文对刺参养殖水体中的氨氮、亚硝酸盐的含量进行了检测。图2显示了投喂粉状饲料和微胶团饲料水体中亚硝酸盐的结果。图2可见，投喂粉状饲料的水体中亚硝酸钠的浓度在第2 d迅速上升，之后上升的速度有所下降；而投喂微胶团饲料的水体中亚硝酸钠的浓度在第2 d较低，但第3、4 d的浓度则出现了快速上升，但其总浓度仍低于投入粉状饲料的水体。

图2 在4 d内投喂不同饲料水体中亚硝酸盐含量的变化

2.2 生长指标

投喂不同饲料的刺参的特定生长率见表3。从表3可以看出投喂粉状饲料与微胶团饲料相比前者的特定生长率稍低，这可能由两方面因素造成：由于粉状饲料溶失率高[7]，导致营养物质的损失；通过微切助技术加工后，能使饲料成分更有利于饲料中营养物质的吸收。添加维生素E的微胶团饲料组，以E100组(100 mg/kg)的特定生长率最高，可能原因是由于维生素E作为一种抗氧化剂和抗应激剂，能降低水产动物的应激反应，此研究结果与鱼类[14-17]、虾[18-19]、蟹类[20-21]结果类似。随着饲料中维生素E含量的升高，刺参的特定生长率呈现出先上升后下降的趋势，这一趋势也与已报道的刺身及其它水产动物的研究结果一致[22-28]。添加维生素E的微胶团饲料组的刺身存活率均为100%，说明饲料中添加维生素E能提高刺参的存活率。

表3 不同的饲料对刺参特定生长率及存活率的影响

2.3 细胞免疫

体腔液细胞组数和呼吸氧爆发的测定结果显示（见表4），粉状饲料组与微胶团饲料组间差异性显著，说明溶失率低的微胶团饲料能提供给刺参更多的营养物质，从而提高刺参细胞免疫水平。添加维生素E的微胶团各组饲料中，体腔细胞总数和呼吸氧爆发分别以E100和E50组较高，造成这一现象的原因可能是由于维生素E本身作为一种抗氧化剂，可能会与氧化性物质反应，降低呼吸氧爆发的水平，此结果与已报道的对虾结果相类似[29]。

表4 投喂不同的饲料对刺参体腔细胞总数、呼吸氧爆发的影响(means±SE,n=3)

2.4 免疫酶

表5 投喂不同的饲料对刺参溶菌酶、酸性磷酸酶活性的影响(means±SE,n=3)

由于刺参是无脊椎动物动物，其免疫以天然免疫为主，天然免疫包括细胞免疫和体液免疫，而免疫酶则是体液免疫的主要手段之一[30]。因此，本文对刺身的免疫酶进行了研究，结果表明（见表5），与粉状饲料相比，微胶团饲料能显著提高刺参的溶菌酶活性。同时，饲料中添加维生素E可刺激刺参的非特异性免疫，提高溶菌酶的活性。其中E100、E200、E500组可以显著提高溶菌酶活力（P＜0.05），以E200组的效果最为明显，继续增加饲料中维生素E添加量，溶菌酶活力反而有所降低。本实验结果类似于已报道的维生素E对鲤鱼血清溶菌酶的作用效果[22]。

酸性磷酸酶（ACP）是巨噬细胞溶酶体的标志酶，也是巨噬细胞内具有代表性的水解酶之一。ACP能帮助刺参将表面带有磷酸酯的异物通过水解作用破坏掉，从而达到预防感染的目的，并能加快对异物的识别、吞噬和清除速度[31]。因此，本文对刺参的ACP进行了考察，实验结果表明（见表5）微胶团饲料组的ACP活性显著高于粉状饲料组，可能原因除了饲料中营养物质溶失率较低外，还与微胶团饲料组水体中氨氮、亚硝酸盐的水平较低有关。其中以E100组的效果最好，说明维生素E的添加是有一个最适水平的，这与张琴的研究结果类似[28]。

3 结论

本文利用微切变助互作技术生产维生素E型微胶团饲料，比较了普通粉状饲料与维生素E型微胶团饲料对养殖环境下刺参水体中氨氮、亚硝酸盐含量及刺参生长免疫的影响。实验研究结果说明，和普通粉状饲料相比，维生素E型微胶团饲料能明显降低养殖水体中的氨氮、亚硝酸盐的水平，提高刺参的特定生长率和免疫水平。另外，在饲料中加入维生素E能显著提高刺参的特定生长率和存活率。饲料中以添加100 mg/kg的维生素E，对刺参生长和免疫的促进效果最好。