口服精胺对哺乳仔猪小肠组织发育的影响

2014-01-22程志斌姜自琴廖国周樊月圆王桂瑛苏子峰毕保良潘洪彬

饲料工业 2014年18期

■程志斌姜自琴廖国周樊月圆王桂瑛苏子峰毕保良潘洪彬汪霞黄伟

（1.云南农业大学，云南昆明650201；2.云南农业职业技术学院，云南昆明 650031；3.大理学院农学与生物科学学院，云南大理671003）

自从Sanguansermsri等(1974)在人奶和牛奶中发现腐胺、亚精胺和精胺这三种多胺活性分子后(Kazuei等，2010)，营养学家对精胺等多胺类活性分子对肠道发育的影响产生了浓厚兴趣。大量研究证明，精胺是多胺的一种，存在于所有真核细胞和原核细胞中，精胺在细胞的增殖、增生和分化等生物过程中有重要的生理作用，尤其是对小肠黏膜上皮细胞等快速增殖和分化的组织细胞（Tabor等，1984）。已有试验证明，猪乳中同样含有丰富的精胺（程志斌等，2010），同时哺乳仔猪和刚断奶仔猪肠黏膜上皮细胞内精胺含量随日龄增加而持续升高（Wu等，2000）。以上这些报告提示，精胺可能是哺乳仔猪肠道发育和成熟的必需活性因子之一。基于这个假设，本试验对幼龄哺乳仔猪进行口服精胺试验，设置不同精胺剂量，测定精胺对小肠重量、长度、绒毛高度和隐窝深度等指标，从形态学角度探讨口服精胺对猪肠道发育和成熟的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验日粮

试验选取6头“长白×大白”妊娠母猪所产的6窝仔猪进行试验。仔猪出生后6 h，每头母猪窝仔数统一为10头。0 d定义为第一头仔猪出生日，仔猪0～10 d维持正常的哺乳。哺乳11 d的早晨07:00～07:30开始试验。所有6窝仔猪逐头称重并记录体重，随后每窝选取6头体重最相近、健康状况良好的仔猪[初始体重(3.50±0.11)kg]，共36头进行试验。试验采用完全随机区组设计，以窝别为区组，每头仔猪为试验重复和单元，精胺每日口服剂量为处理，同窝选取的6头仔猪随机分配到一个精胺剂量处理组，6个处理组精胺剂量分别设置为：0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/kg BW。母猪的哺乳日粮按照NRC（1998）营养推荐量配制玉米-豆粕型粉料，日粮配方和营养水平见表1。

表1 日粮配方和营养水平

1.2 精胺溶液

精胺为Sigma公司（美国）产品，口服精胺溶液由0.9%生理盐水配制成浓度50 μmol/l，处理1组以口服生理盐水替代。

1.3 饲养管理

哺乳母猪采用单栏饲喂管理，栏圈面积1.5×2.1 m2，乳头式饮水器自由饮水，哺乳日粮不限饲，饲喂时间为每日08:00和17:00。产仔舍的温度控制在(22±2)℃，仔猪保温箱通过加热灯维持温度(32±2)℃，产仔舍保持24 h光照。专门饲养员管理母猪采食情况，母猪采食后，剩余在料槽和抛洒在地面的饲料立即清除干净，以防止仔猪采食。同时，哺乳全期所有仔猪不提供补料。在3 d的试验期中，试验仔猪和母猪健康状况良好。

1.4 试验过程

哺乳11～13 d，口服精胺每天1次。每次口服精胺结束后，试验仔猪与其它4头仔猪仍由母猪维持正常哺乳。试验选取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/kg BW这6个精胺剂量的原因是，几次预试验结果显示，精胺剂量低于0.1 mmol/kg BW对仔猪肠道的发育没有显著影响。第14 d的早晨8:00，36头试验仔猪颈静脉放血致死。仔猪小肠被完整取出，在冰盒冷却的铁板上仔细迅速去除肠系膜后，立即测定小肠的长度和重量。

为测定小肠黏膜重量，分别截取十二指肠、空肠和回肠各约10 cm。十二指肠的取样部位从十二指肠的胰管开口处到Treitz结；空肠从小肠中点约50%处采样；回肠从小肠后端约25 cm处到回盲口。所取样品用4℃生理盐水冲洗，剖开肠管，用洁净的干纱布蘸干水分，用双面玻璃刀片仔细完全的刮取肠黏膜，并测定黏膜重量，黏膜重量单位表示为g/10 cm。为了分析肠道绒毛高度和隐窝深度，分别截取十二指肠、空肠和回肠各约2 cm。十二指肠的取样部位在十二指肠的胰管开口处前端2 cm；空肠从小肠中点约50%处采样；回肠的取样部位在回盲口前端2 cm。所有样品立即转入10%甲醛固定液。

1.5 肠道形态学测定

绒毛高度和隐窝深度按照Wu等（1996）的方法进行测定。将固定液中样品取出，修剪成1 cm3大小的样品块。样品在二甲苯中漂洗，并用石蜡包埋。每个包埋好的样品切割出4个5 μm厚的切片，用“苏木红－尹红”染色。切片在尼康双筒目镜(Warsaw公司，波兰)下测定绒毛高度和隐窝深度，放大倍数20。肠绒毛高度是从隐窝开口至绒毛顶端的距离，隐窝深度是基底层至隐窝开口的距离。对于所有肠道形态学测定指标，每张切片至少观察测定20根完整、长且直的绒毛及其相应的隐窝。

1.6 统计分析

统计分析以精胺的剂量为主效应，所有数据进行单因素方差分析和Student-Newman-Keuls多重比较，统计显著性表示为P＜0.05。对产生统计显著性的指标进一步进行一次线性和二次曲线正交分析，以P＜0.05为显著性标准。

2 结果

2.1 不同剂量精胺对哺乳仔猪小肠生长发育的影响（见表2）

表2 不同剂量精胺对哺乳仔猪小肠重量和长度的影响

由表2可知，通过一次线性正交统计分析显示：随着精胺剂量的增加，小肠重量、十二指肠黏膜及空肠黏膜重量显著增加。进一步通过多重比较分析显示：增加小肠重量、十二指肠黏膜及空肠黏膜重量的精胺剂量是0.4～0.5 mmol/kg BW。

2.2 不同剂量精胺对哺乳仔猪十二指肠、空肠和回肠绒毛高度和隐窝深度的影响

十二指肠测定结果显示（图1，A）：精胺0～0.5 mmol/kg BW处理组绒毛高度分别为575、583、569、543、507、495 μm，隐窝深度分别为177、170、183、181、196、192 μm，随着精胺剂量增加，提高了仔猪十二指肠隐窝深度(P＜0.05)，降低了绒毛高度(P＜0.05)。空肠测定结果显示(图1，B)：精胺0～0.5 mmol/kg BW处理组绒毛高度分别为734、725、713、651、612、593 μm，隐窝深度分别为152、159、165、172、178、181 μm，随着精胺剂量增加，提高了仔猪空肠隐窝深度（P＜0.01），降低了绒毛高度（P＜0.01）。进一步通过多重比较分析显示：改变十二指肠及空肠绒毛形态的精胺剂量是0.4～0.5 mmol/kg BW。相对而言，回肠绒毛高度和隐窝深度在各精胺处理组间差异不显著（图1，C）。

图1 不同剂量精胺对哺乳仔猪小肠绒毛高度和隐窝深度的影响

3 讨论

表2试验结果显示，11日龄哺乳仔猪口服精胺0.4～0.5 mmol/kg BW，持续3 d，小肠重量以及十二指肠和空肠黏膜重量显著增加。由于精胺对小肠长度没有影响，显然仔猪小肠重量增加是由于精胺增加了小肠黏膜重量。这一结果与口服精胺增加幼龄哺乳大鼠小肠重量和小肠黏膜重量的试验结果一致（Ka⁃ouass等，1994）。小肠上皮细胞是小肠黏膜组成的基本单位，口服精胺增加小肠黏膜重量暗示精胺促进了小肠黏膜上皮细胞增殖和（或）增生。

小肠黏膜上皮细胞来源于小肠隐窝处的干细胞（stem cell）。隐窝干细胞是隐窝唯一具有分裂和增殖功能的细胞，隐窝干细胞分化形成的肠上皮细胞，从小肠隐窝逐步向绒毛顶端迁移。小肠上皮细胞在迁移过程中逐步完成功能的成熟，这些功能包括正常的消化、吸收和分泌等功能（Yen，2001）。因此，小肠绒毛高度可以作为小肠黏膜上皮细胞功能发育的标志，而隐窝深度则显示隐窝上皮细胞的增殖状况。小肠绒毛高度和隐窝深度这两个形态学指标，作为仔猪肠道发育和成熟的主要标志之一，已经被广泛研究和采纳（Crea等，1988；Cranwell，1994）。Crea等（1988）用扫描电镜观测了0～35日龄哺乳仔猪空肠绒毛的形态变化，试验结果显示，刚出生仔猪空肠绒毛高度较大，随后在哺乳2～5周龄绒毛高度迅速降低。Cranwell（1995）也证实，仔猪出生前10 d肠绒毛高度有增加的趋势，10 d后绒毛高度降低。本试验结果显示，随着精胺口服剂量的增加，仔猪十二指肠和空肠绒毛高度降低，而隐窝深度持续增加，梯度增加口服精胺剂量对11～14日龄哺乳仔猪肠道绒毛高度和隐窝深度的影响，与2～4周更大日龄的哺乳仔猪肠道发育形态学变化过程十分相似。这说明口服精胺促进了幼龄哺乳仔猪小肠形态发育与成熟，肠道形态的提前发育成熟有利于幼龄仔猪更好适应断奶应激。

口服精胺诱导了哺乳仔猪绒毛高度降低和隐窝深度提高，这一结果与口服精胺诱导大鼠肠道形态学的变化结果一致（Buts等，1993；Kaouass等，1994）。精胺诱导哺乳仔猪绒毛高度降低和隐窝深度提高的作用机理可能与上皮细胞周转和隐窝细胞增殖有关（Peulen等，2000）。Peulen等（2000）综述了精胺诱导小肠形态学变化的机理。这个机理包括两个连续的生理过程：第一，外源（口服途径）精胺进入肠道的4 h内被肠道上皮细胞摄入，进入上皮细胞并贮存。由于上皮细胞内精胺浓度迅速增加，诱导了上皮细胞的凋亡（apopto⁃sis），因此导致口服精胺后肠绒毛高度瞬时降低。第二，口服精胺10～48 h后，隐窝干细胞加速分裂增殖，分化出的新上皮细胞由隐窝逐渐向肠绒毛顶端迁移，以弥补精胺诱导的上皮细胞凋亡而引起的肠绒毛上皮细胞损失。因此，口服精胺48 h后，小肠绒毛高度逐步增加，但不能恢复到口服前的水平。小肠黏膜形态学变化与黏膜蛋白质、DNA和RNA含量以及二糖酶比活力等理化指标的变化同步（Sabater-Molina等，2009）。

相对而言，各个精胺处理组间回肠绒毛高度和隐窝深度都差异不显著（图1），这与口服精胺没有显著影响回肠黏膜重量的结果相符（表2），这些结果都说明，本试验条件下口服精胺没有显著改善回肠上皮细胞功能，对回肠的发育没有促进效应。对于口服精胺可以促进小肠前端和中段肠道发育，但对末端小肠发育没有显著效果的这一结果，有待于进一步试验探讨。