枯草芽孢杆菌对蝇蛆饲养效果及抗菌蛋白的影响

2014-01-22雷土青邓江华李建文杨志强

饲料工业 2014年10期

■雷土青邓江华李建文杨志强

(武汉轻工大学湖北省饲料工程技术研究中心，湖北武汉430023)

蝇蛆具有繁殖速度快、营养价值高、饲养周期短等特点，体内还含有大量活性蛋白，是一种具有巨大开发和应用潜力的昆虫蛋白资源之一。蝇蛆食性杂，且能在充满细菌的恶劣环境下生长。用畜禽粪饲养有非常好的效果，畜禽粪在我国产量非常大，可大大降低生产成本。研究表明，蝇蛆体内含有抗菌蛋白、抗菌肽、壳聚糖等抗菌活性物质，而且热稳定性高，具有很好的开发应用前景。Schmidtmann（1992）等研究表明，蝇蛆在完全无菌的环境下不能完成正常的生长发育历程，而细菌能为蝇蛆提供大量营养物质，如氨基酸、脂肪酸、维生素等，促进蝇蛆生长发育。蝇蛆在未诱导的情况下能产生抗菌肽等活性物质，用细菌针刺法和饲喂法都能不同程度地提高蝇蛆体内抗菌蛋白/肽的含量及其杀菌活性。因此，饲料中细菌含量能影响蝇蛆生长发育及其体内抗菌活性物质的含量。本文通过在麦麸中添加枯草芽孢杆菌，以研究其对蝇蛆饲养效果、抗菌蛋白含量及其抗菌活性的影响，为在卫生饲料饲养条件下蝇蛆活性蛋白/肽的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 饲料

所用饲料为市售麦麸。

1.1.2 菌种

枯草芽孢杆菌、大肠杆菌K88由湖北省饲料工程技术研究中心实验室提供。

1.1.3 主要试剂

苯甲基磺酰氟（上海源叶生物科技有限公司），β-巯基乙醇（上海诚心化工有限公司），LB培养基（OXID公司），考马斯亮蓝染色试剂盒（南京建成生物工程有限公司），硫酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、NaCl等试剂为国产分析纯。

1.1.4 主要仪器

高速组织捣碎机（JJ-2）(常州国华电器有限公司)，大容量离心机、紫外分光光度计、恒温生化培养箱、电子分析天平（AR-2140奥豪斯仪器（上海）有限公司）、恒温烘箱、微量凯氏定氮仪、索氏提取器、箱式高温电炉等。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

以麦麸为基础饲粮，分别添加枯草芽孢杆菌菌粉0（对照组）、0.3%、0.6%，加水混匀，并保温24 h后，按一定饲养密度投入1日龄幼蛆，饲养至4日龄。

1.2.2 生长指标测定和计算公式

收集4日龄蝇蛆和残料，鲜蛆风干表层水分后称重，残料称重，随机取约100头鲜蛆，计算平均单头蛆重。鲜蛆和残料分别取样，在(105±2)℃恒温烘箱中烘干至恒重，在干燥器中冷却后，称重，分别计算蝇蛆干物质得率和残料干重。

平均单头蛆重（mg）=鲜蛆样重（g）/鲜蛆数（头）×1 000；

蝇蛆干物质得率（%）=样蛆干重/样蛆鲜重×100；

净料重比=原料重/（鲜蛆总重-1日龄幼蛆重）；

饲料净消耗量（%）=（原料绝干物料重-残料重×残料干重）/原料绝干物料总重×100。

1.2.3 蝇蛆和物料营养成分

将蝇蛆、残料及原料绝干样用微量凯氏定氮法测粗蛋白含量，用索氏提取法测粗脂肪含量，用550℃高温灼烧法测粗灰分含量。

1.2.4 组织匀浆法提取抗菌蛋白

称取一定量4日龄鲜蛆，按液(ml)∶固(g)比为3∶1加入4℃下预冷的提取缓冲液（pH值7.0，50 mmol/l PBS，35 μg/ml苯甲基磺酰氟，0.2%巯基乙醇），充分匀浆，于4 ℃、4 000 r/min离心30 min，过400目纱布，取滤液即为蝇蛆抗菌蛋白粗提液Y。粗提液Y于4℃、12 000 r/min离心30 min，过400目纱布，滤液即为粗提液G，于-20℃下保存备用。

1.2.5 粗提液总蛋白浓度差异检测

用Bradford法检测粗提液Y和G的总蛋白浓度（mg/ml）。

1.2.6 粗提液抗菌活性检测

用抑菌圈法检测抗菌活性，指示菌为大肠杆菌K88。LB液体培养基接种大肠杆菌，摇床培养活化细菌至OD600≈1.0，将活化后的菌液按1∶1 000的比例加入到LB固体培养基中，摇匀，倒平板。把直径(d)为6 mm的灭菌滤纸片均匀放在培养基表面，每平皿7片，每片点样20 μl，静置30 min，于37℃恒温生化培养箱中倒置培养10～12 h，测抑菌圈。

1.2.7 数据统计

试验结果用“平均值±标准差”表示，用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌对蝇蛆生长性能和物料消耗量的影响（见表1）

表1 枯草芽孢杆菌对蝇蛆生长性能和物料消耗量的影响(n=3)

如表1所示，0.3%组蝇蛆平均单头蛆重最大，试验组蝇蛆干物质得率平均提高1%～2%，料重比明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，枯草芽孢杆菌对饲料净消耗量没有明显的影响(P＞0.05)。结果表明，麦麸中添加枯草芽孢杆菌能明显提高蝇蛆生产效率。

2.2 枯草芽孢杆菌对蝇蛆和物料营养成分的影响（见表2）

表2 枯草芽孢杆菌对蝇蛆和物料营养成分的影响（%，n=3）

如表2，麦麸中添加枯草芽孢杆菌，蝇蛆粗脂肪含量提高2%～5%（P＜0.01），添加量越大，脂肪含量越高。试验组蝇蛆粗蛋白质和粗灰分含量均低于对照组，但没有明显的差异（P＞0.05）。各组残料的粗蛋白质均明显低于原料（P＜0.05或P＜0.01），粗脂肪的消耗量各组没有明显差异，而试验组极显著低于原料（P＜0.01），营养物质的消耗导致粗灰分含量明显增多（P＜0.01）。

2.3 枯草芽孢杆菌对蝇蛆粗提液总蛋白浓度差异的影响（见表3）

表3 枯草芽孢杆菌对粗提液总蛋白质浓度的影响(mg/ml，n=3)

本试验采用组织匀浆法提取蝇蛆抗菌蛋白，由表3可知，试验组粗提液Y的总蛋白质浓度有所提高（P＞0.05），0.3%组粗提液G中总蛋白质浓度比对照组提高了2.25个百分点（P＜0.05），0.3%和0.6%组之间粗提液总蛋白浓度没有明显差异（P＞0.05）。

2.4 蝇蛆粗提液抗菌活性差异（见图1～图2）

图1 枯草芽孢杆菌组

图2 对照组

由图1及图2可知，表明试验组抗菌活性要比对照组略高，但是没有明显的差别，与粗提液Y的总蛋白浓度差异相符。图1中各个纸片抑菌圈大小和透明程度相当，表明0.3%和0.6%组之间没有明显的差异。

3 讨论

试验发现，麦麸用枯草芽孢杆菌发酵后饲养蝇蛆，能明显提高蝇蛆生长发育速度和干物质沉积率，对饲料净消耗量和营养成分的消耗比重差异不明显（P＞0.05），可能是枯草芽孢杆菌本身成为蝇蛆的食物促进蝇蛆生长；枯草芽孢杆菌本身能分泌大量酶类物质，改善饲料品质，产生更多的氨基酸、脂肪酸、维生素、可溶性还原糖等，这些物质有利于蝇蛆消化吸收。

采用组织匀浆法得到的蝇蛆抗菌蛋白粗提液，试验组粗提液Y的抗菌活性有所提高，但没有明显的差异，可能是枯草芽孢杆菌发酵后，饲料中细菌种群结构单一，以枯草芽孢杆菌为主，而这种细菌对蝇蛆抗菌蛋白诱导能力不如大肠杆菌等G-菌。