响应面法优化芽孢杆菌BY-3产纤维素酶发酵培养基

■孟凡旭 马 丽 杨伟平 姬生跃 辛海云 曹斌云

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100）

近年来，随着世界人口的急剧增加和畜牧业的持续快速增长，使得粮食供需矛盾愈加突出。纤维素（cellulose）是地球上分布最广、含量最丰富、有巨大潜力的可持续能源物质和可再生资源[1]。在我国，每年生产作物秸秆7亿多吨，除了反刍动物可以利用瘤胃微生物降解转化部分外，大部分不但不能被动物消化利用，反而影响其对蛋白质、淀粉等营养物质的吸收。纤维素酶（cellulase）是能水解纤维素β-1，4糖苷键，使纤维素降解生成纤维二糖和葡萄糖的一类酶的总称[2]，在动物饲料中添加纤维素酶，可以改善饲料的营养价值，提高动物对纤维素类饲料的利用效率。因此，合理利用农作物资源、提高微生物产纤维素酶的产量对于改善饲料利用效率，解决粮食危机、环境污染等具有重大的现实意义。当前，工业和实验室用纤维素酶的主要菌源为真菌，但是由于细菌易培养、生长速度快、产酶周期短且所产酶具有良好的稳定性(热、pH值)[3]等优点，成为工业酶最重要的菌源之一。一些嗜热的纤维素酶生产菌株已经被分离出来[4-5]。微生物发酵培养基是影响纤维素酶产量和生产成本的重要因素[6]，很多研究者对优化产纤维素酶的发酵培养基进行了研究，但是大多基于单因素和正交试验设计，无法考察培养基中各组分间的交互作用，也就不能提供培养基中各组分的最佳组合[7]。响应面分析（RSM）结合了数学和统计学研究方法，通过回归分析，拟合因素与试验结果（响应值）之间的函数关系，并对多项式中各因素的水平及交互作用对响应值的作用进行优化和评价，可以用最少的试验次数有效确定多因子系统的最佳条件[8-9]。该方法已广泛应用于各类发酵培养基及发酵条件等的优化实践中[10-13]。然而，采用单因素试验与RSM结合的优化方法，系统的对微生物产酶发酵培养基进行设计、优化的报道较少。嗜热芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BY-3是本实验室从成年藏猪的盲肠内容物中分离筛选出的具有降解纤维素能力的菌株。本研究旨在①降低发酵培养基的生产成本。通过单因素优化试验从廉价的农业废弃物和工业副产品中筛选出经济高效的碳源和氮源；②提高纤维素酶的产量。分别利用Plackett Burman（PB）设计、最陡爬坡试验和中心组合设计（CCD）对该菌株的发酵培养基组分进行优化，得到最高效的产酶培养基。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

B.subtilisBY-3是由本实验室从藏猪盲肠内容物中分离、筛选所得，现保藏于中国武汉典型培养物保藏中心（保藏号：CCTCC No.M2013382.）。

1.1.2 培养基

种子培养基（g/l）：蛋白胨10、酵母粉 5、NaCl 5、玉米粉5。

结合文献[14-15]，产酶发酵基础培养基：MgSO4·7H2O 0.3 g/l，K2HPO4·3H2O 1.5 g/l，NaCl 5 g/l，酵母粉0.5 g/l，蛋白胨20 g/l，羧甲基纤维素钠（CMC）20 g/l，CaCl2·2H2O 0.1 g/l，吐温80 0.1%(v/v)。

试验所用蛋白胨、酵母粉、琼脂粉购自OXOID公司；CMC购自Sigma公司，其它化学试剂均为国产分析纯产品。以上所有培养基均于121℃高压蒸汽灭菌20 min，试验所用不溶解的纤维素类物质先在60℃烘箱中干燥48 h，再经60目筛子过滤后使用。

1.1.3 主要仪器

NanoDrop公司的ND-1000型紫外分光光度计、Beckman CouLter Allegra64R台式高速冷冻离心机、日本TOMY公司SX-500高压灭菌锅、HZQ-F160振荡培养箱、方舟科技E-331/S-3+酸度计等。

1.2 方法

1.2.1 发酵条件

根据本实验室的前期研究，本研究所有发酵试验皆在如下发酵条件下进行：装剂量50 ml/250 ml、接种量3%、发酵温度42℃、发酵时间24 h、培养基初始pH值6.5±0.1。

1.2.2 发酵培养

自斜面挑取1单一菌落接种于装有50 ml种子培养基的250 ml三角瓶中，37℃ 、220 r/min下振荡培养12 h，使菌体处于对数生长期。随后，将种子液以3%的接种量接种于相应的发酵培养基中（依照试验设计），每批次的发酵都在装有50 ml发酵培养基的250 ml三角瓶中进行。

1.2.3 纤维素酶活性测定方法

粗酶液的的制备：经24 h深层发酵的发酵培养液，在4℃冷冻低温离心机中以10 000 r/min离心30 min，除去菌体及培养基残渣，收集上清液即为粗酶液。

羧甲基纤维素酶（CMCase）活性测定：采用IUPAC标准化方法[16]，依据DNS（3,5-二硝基水杨酸）比色法原理绘制葡萄糖标准曲线[17]。简而言之，吸取1 ml含有1%（w/v）CMC底物的50 mmol醋酸盐缓冲液(pH值5.5)至25 ml的刻度试管中，再加入1 ml经过适当稀释的粗酶液，振荡混匀后在50℃保温30 min。然后加入3 ml DNS试剂终止酶解反应，沸水浴加热5 min，流水冷却至室温，加水至25 ml后混匀。于540 nm处测定吸光度，加热失活的酶液作为空白对照，测得OD值后查阅葡萄糖标准曲线，求得从底物CMC上生成还原糖的量。本研究将在上述条件下每分钟催化底物生成1 μmol还原糖所需酶量定义为一个酶活力单位，用U/ml表示。

1.2.4 培养基中最优碳源和氮源的筛选

以纤维素酶CMCase活性为衡量标准，分别以葡萄糖、大麦秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆、可溶性淀粉、麦麸以及CMC作为产酶发酵基础培养基中的单一碳源。将种子液按3%的接种量接种，42℃、220 r/min下深层发酵24 h后进行CMCase活性测定。在确定了最优碳源的基础之上，分别以硫酸铵、尿素、豆粕、酵母粉以及蛋白胨作为培养基中的单一氮源进行发酵试验，在相同的发酵条件下深层发酵24 h后进行CMCase活性测定。

1.2.5 PB筛选试验

PB设计是一种2水平的筛选试验方法，可以用最少的试验次数从众多的考察因素中高效地筛选出显著影响响应值的因素以供进一步研究[18]。依据细菌生长所需营养要素的基本需求，本次试验选取碳源、氮源和6个潜在影响BY-3纤维素酶产量的培养基组分（金属离子、营养素等）作为变量，同时设立3个虚拟变量减少系统误差，以CMCase活性作为响应值。通过对试验数据进行回归分析获得一个多元一次回归方程：

式中：Y——预测响应值；

β0——模型常量；

βi——一次系数；

Xi——独立变量编码值。

1.2.6 最陡爬坡试验

为了快速逼近最大的响应区域，选取显著影响纤维素酶酶活的因素进行最陡爬坡试验。依据PB筛选试验结果中多元一次方程回归系数的正负和大小决定各显著因素的最陡上升路径，其它因素保持在PB试验的较低水平。

1.2.7 CCD和响应面分析

CCD是一种常见的响应面分析方法，不仅可以减少试验次数，而且可以考察各因素间的交互作用。根据PB设计和最陡爬坡试验结果，通过2因素（NaCl、玉米秸秆）5水平（-1.414、-1、0、+1和+1.414）的CCD方法来确定各显著因素的最优水平。为了预测最高CMCase活性的因素组合，根据试验数据得到一个以酶活为响应值的多元二次方程模型：

式中：Y——预测响应值；

β0——模型常量；

Xi、Xj——独立变量编码值；

βi——一次系数；

βii——二次系数；

βij——交互作用系数。

1.2.8 数据统计分析

每组试验平行三次，试验数据用“平均值±标准误”表示；采用Minitab 16和Design Expert 8.0软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 培养基中最优碳源和氮源的筛选(见图1)

图1（a） 不同碳源对产酶活性的影响

图1（b） 不同氮源对产酶活性的影响

如图1（a）所示，B.subtilisBY-3能在不同程度上利用CMC、大麦秸秆、玉米秸秆、可溶性淀粉、麦麸和小麦秸杆，而不能有效利用葡萄糖产纤维素酶，其中以玉米秸秆为单一碳源的发酵培养基中CMCase活性最高，可达(2.917±0.125)U/ml。因此，选择价格低廉且产酶活力高的玉米秸秆作为最佳碳源进行后续试验。对于氮源，如图1（b）所示，此菌株基本不能利用硫酸铵和尿素两种无机氮源，当以蛋白胨和豆粕分别作为单一氮源时，CMCase活性最高，分别可达到(2.96±0.057)U/ml和(2.837±0.146)U/ml。由于蛋白胨属于分析纯制剂，价格昂贵，不利于纤维素酶的大规模生产，因此采用成本较低的大豆工业副产品——豆粕作为最佳氮源进行进一步研究。

2.2 PB筛选试验

分别选取玉米秸秆、豆粕作为发酵培养基的碳源和氮源，综合考虑其它影响微生物产纤维素酶的微量元素，如 NaCl、MgSO4[19]、K2HPO4、Ca2+和吐温 80[14-15,20]。本研究选取8个潜在的影响B.subtilis BY-3产纤维素酶的因素进行PB分析。PB试验设计与结果如表1所示，每个因素分别选取高（+1）低（-1）两个水平，以CMCase活性为响应值，得到8因素12试验组合（虚拟变量未显示）。

表1 Plackett-Burman筛选试验设计及结果

PB试验的方差分析（ANOVA）结果如表2所示，对产酶有显著影响（置信区间大于95%）的因素有Na-Cl和玉米秸秆。其中NaCl对产酶有显著的负效应（P＜0.05），可适当降低其浓度；玉米秸秆对菌株产酶有极显著的正效应（P＜0.01），可适当增大其浓度。然而，其它6个因素对产酶没有显著的影响，考虑到生产成本，应维持在较低的水平。对PB试验所得的数据进行回归分析，得到关于各因素与响应值（CMCase活性）的多元一次方程：

式中：Y——纤维素酶CMCase活性预测值；

X1～X8——8个因素的偏码值。

该模型中决定系数（R2）为98.3%，表明98.3%的纤维素酶酶活变化可以用该模型来解释，方程的拟合度和模型的相关性良好；此外，调整性决定系数(Adj R2)为93.77%，也进一步证明了该模型的可靠性。综合以上结果，对B.subtilisBY-3产酶影响显著的因素有NaCl和玉米秸秆，可作进一步的优化，而其它因素则维持在低水平。

表2 Plackett-Burman设计各因素效应评价和统计分析

2.3 最陡爬坡试验（见表3）

响应面法虽然可以高效的分析因素间的交互作用，但是只有在考察最大响应值的邻近区域里才能较好的进行方程拟合，更好的反映真实情况[21]。为了逼近最大产酶区域，根据PB试验筛选出的显著因素效应值的正负和大小，并结合之前的试验经验进行最陡爬坡试验。本研究以PB试验的中心点为爬坡起点，分别以-0.5 g/l和1 g/l作为步长依次降低NaCl的浓度、提高玉米秸秆的浓度。由表3可知，纤维素酶酶活随着爬坡的进行逐渐增高，当NaCl和玉米秸秆的浓度分别达到6 g/l和28 g/l时，酶活达到最大值（5.219±0.073）U/ml，表明最大产酶区在No.4组试验附近。最陡爬坡试验将为接下来的响应面分析提供试验依据。

表3 最陡爬坡试验设计

2.4 CCD和响应面分析（见表4）

表4 中心组合响应面试验设计及结果

在PB试验和最陡爬坡试验的基础之上，运用Design Expert 8.0软件设计了2因素5水平共13组的CCD试验，其中试验中心点为No.4（6，28）。由表4可知试验中各因素的试验值及编码值，同时也相应给出了试验测得的CMCase活性及相应的预测响应值。

利用Design Expert 8.0软件对中心组合试验结果进行响应面回归分析得到B.subtilisBY-3产纤维素酶CMCase活性（Y）对NaCl（X3）和玉米秸秆（X6）的多元二次回归方程，如下所示：

式中：Y——预测的响应值（CMCase活性）；

X3、X6——分别是NaCl和玉米秸秆的编码值。

对该二次回归模型的ANOVA结果如表5所示，在这个模型中对产酶影响极显著(P＜0.01)，而X3和X6的交互作用对产酶影响不显著(P＞0.05)。模型的P值为0.000 2,表明方程拟合度较好,在α=0.01水平上回归极显著；失拟项P值为0.064 5，表明残差由随机误差引起，该模型选择较好；决定系数R2为0.953 7，说明预测值与试验测量值之间高度相关；调整性决定系数（Adj R2）为0.920 7，进一步表明该模型具有极高的可信度，可以用来描述试验结果。上述多元二次回归方程的三维响应曲面及其等高线图如图2所示，图中形象地描述了NaCl和玉米秸秆两个因素与响应值之间的作用关系，在NaCl和玉米秸秆的浓度分别为5.772 g/l和28.499 g/l时，回归模型存在稳定点，此时CMCase活性达到最高值5.263 U/ml。

表5 响应面试验结果的方差分析

2.5 验证试验

为验证RSM及结果的可靠性，在发酵条件不变的情况下分别于产酶发酵基础培养基和优化后的发酵培养基中进行试验（每组3个平行），经酶活测定，后者的平均纤维素酶活为(5.305±0.073)U/ml，与RSM预测的结果(5.263 U/ml)非常相近，说明试验值与模型预测值拟合良好，该模型可以用来预测该菌株液体发酵的产酶水平；而基础培养基的平均酶活为(1.683±0.049)U/ml。经优化，该菌株最优的发酵培养基为：MgSO4·7H2O 0.3 g/l，K2HPO4·3H2O 1.5 g/l，NaCl 5.772 g/l，酵母粉 0.5 g/l，豆粕 20 g/l，玉米秸秆28.499 g/l，CaCl2·2H2O 0.1 g/l，吐温80 0.1%(v/v)。

图2 玉米秸秆和氯化钠对羧甲基纤维素酶活性的响应面图及等高线图

3 讨论

纤维素酶在食品加工、饲料工业、纺织制造等很多领域发挥着重要作用，对处理农业废弃物、解决粮食危机等具有重大潜力[22]。尽管有很多微生物能够生产纤维素酶，但是纤维素分解菌的产酶活力偏低、发酵成本过高，严重制约着纤维素酶的规模化生产和工业应用。

藏猪是我国特有的草食地方猪种，在舍饲的条件下，仍可用90%的饲草来满足其营养需要[23-24]，可见在藏猪肠道内存在着能分解纤维素的微生物。在本实验室先前的研究中，一株嗜热的纤维素分解菌B.subtilisBY-3从健康的成年藏猪的盲肠内容物中成功的筛选出来，研究其特定的产酶条件对于揭示藏猪的食草机理，乃至提高动物对粗纤维饲料的利用率具有重要意义。本研究旨在应用统计学试验方法设计并优化B.subtilisBY-3的产酶发酵培养基，以降低发酵生产成本、提高纤维素酶的产量。首先通过单因素试验筛选出以玉米秸秆和豆粕为主要原料的BY-3液体发酵培养基。玉米秸秆是一种含量丰富、廉价易得的农作物废物。在我国，玉米、水稻和小麦是我国的主要粮食作物，每年由此产生的农业秸秆数量巨大，其中玉米秸秆约占秸秆总量的32.3%[25]；在美国，每年生产玉米秸秆达1.96亿吨[26]。玉米秸秆中含有细菌生存所必需的营养素，其中纤维素含量约为25%～35%[27-28]，是B.subtilisBY-3产纤维素酶的理想碳源和诱导剂。玉米秸秆不仅可以降低发酵成本，而且为农作物秸秆的有效利用、饲料资源的开发提供了重要依据。在单因素试验的基础之上，为了使纤维素酶产量最大化，本研究采用RSM对发酵培养基进行了深度优化。该方法在生产实际中已得到广泛应用，Reddy等[29]利用响应面法优化Bacillus sp.RKY3菌株的发酵条件，蛋白酶产量增加了近1.3倍；张欢等[30]采用该方法优化HA-A38菌株的发酵培养基，菌体浓度是优化前的近2倍。本研究首先采用二水平设计的PB筛选试验分析了8种潜在因素对B.subtilisBY-3产纤维素酶的影响，并通过最陡爬坡试验快速高效地逼近了最大的纤维素酶酶活的区域，最后通过CCD和响应面分析确定了NaCl和玉米秸秆的最优浓度。在最优发酵培养基的基础之上，以3%的接种量42℃、220 r/min条件下深层发酵24 h后纤维素酶CMCase活性达(5.305±0.073)U/ml，通过单因素和响应面结合的优化方法，产酶量较优化前基础发酵培养基条件下[(1.683±0.049)U/ml]提高了3.15倍，同时显著降低了发酵成本，这对纤维素酶的规模化生产、酶制剂的开发、作物秸秆的有效利用都具有重要的借鉴意义。研究同时进一步证明，单因素试验和响应面法相结合是一种行之有效、科学合理的优化响应值的方法，可以用来设计和优化微生物的发酵产酶培养基。

4 结论

①B.subtilisBY-3可以高效利用廉价易获取的农业废弃物、工业副产品作为碳源（玉米秸秆）和氮源（豆粕）来生产纤维素酶，将大大降低生产成本。

②B.subtilisBY-3最优的发酵培养基为：Mg-SO4·7H2O 0.3 g/l，K2HPO4·3H2O 1.5 g/l，NaCl 5.772 g/l，酵母粉0.5 g/l，豆粕20 g/l，玉米秸秆28.499 g/l，CaCl2·2H2O 0.1 g/l，吐温80 0.1%(v/v)，在此条件下，酶活较基础培养基提高了3.15倍。