精子发生和运动相关蛋白的研究新进展

汪智琼李红飞张 玲刘晙玭平光伦张志兵,.武汉科技大学医学院公共卫生学院（武汉 430065）; 2. Departments of Obstetrics and Gynecology and Biochemistry, Virginia Commonwealth University, Richmond, VA 23298

·综 述·

精子发生和运动相关蛋白的研究新进展

汪智琼1李红飞1张 玲1刘晙玭1平光伦1张志兵1,2*1.武汉科技大学医学院公共卫生学院（武汉 430065）; 2. Departments of Obstetrics and Gynecology and Biochemistry, Virginia Commonwealth University, Richmond, VA 23298

近年来男性不育症的发病率有不断上升趋势，在男性不育的各种原因中，精子发生障碍是一个重要因素，其中遗传因素缺陷导致的精子发生障碍是一个重要机制[1]。男性精子发生是一个复杂的细胞分化过程，受到诸多有序表达基因的调控，其中任何一个基因发生缺失、突变或表达异常都可能引起精子生成障碍，导致男性不育[2]。近年来随着小鼠基因敲除技术的广泛运用，越来越多调节精子发生的基因被发现[3]，据报道目前有超过2300个基因参与[4]。其中有些蛋白在精子发生中发挥重要的功能，如调控哺乳动物精子发生、精子运动、精子获能、顶体反应和精卵融合等生物过程，另外有些精子抗原可能与受精和胚胎的早期发育有密切关系 。本文基于目前国内外的研究报道，综合论述了几种重要的蛋白调节精子鞭毛运动的机制。

一、精子相关抗原6（Sperm- associated antigen 6，SPAG6）

SPAG6基因表达蛋白是精子鞭毛支架蛋白的一种，对维持精子鞭毛结构完整和精子鞭毛活动有重要作用。SPAG6最初是用不育男性患者的高滴度抗体血清筛选睾丸基因表达文库而克隆出来的，SPAG6基因缺失或沉默时,动物表现为精子活力损伤、精子畸形和雄性不育[5]。目前对人类和鼠类的SPAG6基因的研究发现，该基因均在睾丸中高度表达，编码1.8kb和2.8kb mRNA[6]。此外，具有运动纤毛的组织，如肺、脑室膜中SPAG6也有少量表达，另有报道北京油鸡SPAG6基因位于2号染色体上，共有l0个外显子和9个内含子，基因全长为32.6 kb,该基因突变影响其精液品质和性发育相关性状[7]。体外转染实验中，通过免疫荧光实验在激光共聚焦扫描显微镜下发现，该蛋白在真核细胞中定位于微管。在运动纤毛内，SPAG6定位于调节纤毛运动的中心轴突上，并且决定其他蛋白（如SPAG16，SPAG17）在中心轴突的定位[8,9]。哺乳动物SPAG6的功能非常保守，在低等生物，如双鞭毛藻类中是衣藻PF16（paralysed flagella 16）的同源体，该同源蛋白PF16也位于鞭毛中央轴突的中心管内参与调节鞭毛的运动[10]。目前，SPAG6基因敲除小鼠模型已经建立，SPAG6缺失小鼠由于运动纤毛功能障碍而表现出雄性不育。有研究显示，SPAG6该蛋白在微管及中心体（一种微管组织中心）中表达，近一半SPAG6缺失小鼠生长较正常小鼠显著减慢，提示SPAG6可能和细胞生长有关。最近研究表明SPAG6作为新型癌胚抗原，在肺癌等肿瘤组织中表达显著增加，表明该基因跟肿瘤形成有关[11]。因此，SPAG6的功能远远超过了维持精子鞭毛结构完整和精子鞭毛活动的功能。

二、精子相关抗原16（Sperm-associated antigen 16，SPAG16）

哺乳动物SPAG16是衣藻PF20（paralysed flagella 20）的同源体[12]，对维持和执行“9+2”结构有重要的作用。“9+2”轴丝是在运动纤毛和鞭毛内发现的，是由9个双峰微管通过能够产生协同力的肌动复合物-肌动蛋白臂的机动作用连接到一对中央微管，是一种细胞骨架结构[13]。衣藻PF20基因只翻译一个蛋白，该蛋白位于衣藻鞭毛中央轴突的中心管内以调节鞭毛运动，当PF20的表达缺失时，鞭毛运动力丧失。同衣藻PF20不同，小鼠SPAG16基因翻译两个蛋白， 全长71 kDa 的SPAG16L及35 kDa 的SPAG16S[14]。SPAG16L蛋白被发现存在于所有鼠类的运动纤毛和鞭毛中，定位于运动纤毛中心管，同衣藻PF20一样调节鞭毛运动[15]。SPAG16S同SPAG16L的C 端序列完全相同，表现为SPAG16L的C 端蛋白，该蛋白仅在雄性精子细胞中表达，显著性表达于核的特殊区域，有7个WD重复序列以介导蛋白相互作用。与SPAG16L不同，SPAG16S除在生精细胞胞浆中表达外，还在细胞核中表达，该蛋白参与调节精子发生[16]。在纯合子小鼠中敲除SPAG16L基因，仅仅表现为雄性不育，但精子发生过程无异常表现。但如果同时敲除SPAG16L和SPAG16S的表达，可见在精子发生过程中出现了严重的缺失。将SPAG16S转染到鼠精子细胞和BEAS-2B（人类支气管分泌壁细胞）中，可增加SPAG16L的表达。以上实验证实SPAG16S在精子细胞的基因表达系统中起了非常重要的作用。

为了进一步检测SPAG16L的功能，有学者建立SPAG16L缺失的基因敲除小鼠模型，结果发现转基因小鼠仍可表达SPAG16S，基因突变的动物发育正常，未出现纤毛缺失相关症状如脑水肿，脑侧偏瘫缺失，鼻窦炎，支气管炎或多囊肾等。然而，雄性不育个体的精子在数量上比正常精子数低，精子的活动力明显缺失（尽管在结构上的异常没有得到证实）。此外，会出现少量生精小管中的生精细胞退化，因此可得出以下结论：SPAG16可通过影响精子数量及活动力，对精子鞭毛的功能起重要的作用。

有文献进一步证实[17]，缺乏SPAG16L基因的正常纯合小鼠，鞭毛回应钙的能力下降，直接影响了鞭毛接受微管滑动动力蛋白的作用，使精子鞭毛发生弯曲，进而影响了精子的运动力。综上所述可见，SPAG16L是维持正常精子运动力和男性生育能力必不可少的基因。

三、有丝分裂表达基因1（ meiosis expressed gene 1，MEIG1）

前面已述SPAG16基因是精子形成的重要调节因子。SPAG16S是SPAG16基因的一个亚型，分子量为35kDa，首先被发现在精子发生中扮演着重要角色，酵母双杂交实验表明，其与减数分裂表达基因1（MEIG1）可发生蛋白间的相互作用。有文献报道[18]，当MEIG1基因缺失后，突变雄性小鼠在减数分裂过程中未见明显异常，但在精子发生阶段的延长和浓缩阶段出现明显缺陷。在MEIG1基因缺失小鼠中，通过透射电子显微镜观察显示，一种叫精子领的结构是精子头部和鞭毛形成必不可少的微管细胞器。MEIG1基因和Parkin基因联合调节精子，MEIG1基因缺失小鼠同时在睾丸组织中出现PACRG蛋白表达减少。MEIG1基因在精子轴丝/鞭毛的装配以及PACRG缺失基因小鼠模型的生殖表型中发挥着重要作用。MEIG1/PACRG在精子领（manchette）结构功能和精子控制方面的伙伴关系提供了关键角色[19]。

MEIG1的功能仍然不明，之前的研究显示MEIG1与SPAG16S相关联，SPAG16S蛋白是一种精子发生必不可少的核蛋白。最近的研究还表明，MEIG1可能是精子发生和纤毛功能形成必不可少的。MEIG1的表达在热休克转录因子2（Hsf2）突变小鼠体内大为降低，这可能导致该突变小鼠生精障碍和生育能力下降[20]。生物信息学分析显示，MEIG1在鞭毛细胞丰富的组织中表达最多，如睾丸、肺、嗅感觉神经元等，因此推断MEIG1对鞭毛功能形成有很重要的作用[21]。

为了研究MEIG1基因潜在的功能，有学者建立了MEIG1的条件基因敲除小鼠模型，并通过与CMVCre转基因小鼠交配，使得MEIG1基因在小鼠体内完全删除。基因敲除小鼠的研究表明可获得纯合子的小鼠，但雄性小鼠是不育的，仅能产生少数形态异常的精子，精子发生在延伸和浓缩阶段大幅减值。这些研究表明，MEIG1是精子形成调控的关键蛋白。以前的研究认为，MEIG1在减数分裂中可能发挥着作用。但最新的实验进一步揭示MEIG1非减数分裂所必需的，但对于精子形成是必须的。

四、S-SOX5（SRY-related High Mobility Group Transcription Factor）

SOX5来自成人睾丸的cDNA文库，是被发现的SOX（Sry-type HMG box）基因群的新成员，SOX基因群是人类Y染色体性别决定基因中的一类基因，该基因是作用于睾丸而非卵巢组织[22]。SOX基因分为10组，由A-J，它们分别调节不同组织的发育过程。SOX5是SOXD中的成员，含有仅在成人睾丸高表达2kb的S-SOX5和在其他组织中表达6kb的L-SOX5，S-SOX5编码48kDa的蛋白缺乏N-端，分子量是L-SOX5编码的蛋白的一半[23]。有文献报道[24]，SOX5的过度表达与前列腺癌的发生有联系。此外，当SOX5在12p12.1处单剂量不足，表现出语言发育迟缓，行为能力问题和轻微的变形特征[25]。最先在鼠类中被发现的是S-SOX5，高度同源于SOX5，一直被命名为SOX5出现于许多文献中，然而，近期证实人类和鼠类都被发现有L-SOX5的存在，但是大多数作者将这作为SOX5同种型，L-SOX5在软骨细胞与条纹肌肉细胞中高度表达，与SOX6高度同源[26]，提示可能在人类软骨和肌肉发展中起作用，有文献报道[27]，L-SOX5和SOX6，SOX9共同在人类间质干细胞的介导下参与软骨的形成，调节肌细胞的形成。Kiselak等的文章指出[28]，S-SOX5是调节精子相关抗原SPAG6的一个重要转录因子，之前的研究已经表明，SPAG6对维持精子鞭毛结构完整和精子鞭毛活动有重要作用，直接影响了精子的发生和运动。经过一系列分子生物学实验后发现，当S-SOX5在BEAS-2B细胞中过度表达时，SPAG6的基因表达就向上调节，当S-SOX5用RNA干扰，抑制其表达时，SPAG6的基因表达就向下调节。由此可见，S-SOX5是调控SPAG6的一个重要因子，在调节运动鞭毛的形成和维持其功能扮演着重要的角色。S-SOX5的表达直接影响着SPAG6的表达，也就间接地影响了精子的发生和运动。

五、睾丸特定激酶（TSSK2）

SPAG16L编码的蛋白对正常精子的活力和雄性生殖力有着重要的作用，SPAG16L包含许多潜在的磷酸化位点，并且该蛋白已被证实是在体内进行磷酸化[29]。酵母双杂交实验发现了睾丸特定激酶TSSK2[30]，可能是能与SPAG16L发生反应的重要蛋白。TSSK2和SPAG16L的相互作用是通过免疫共沉淀实验得到进一步证实：这两种蛋白都取自睾丸和一些能表达该两种蛋白的细胞溶解物，通过共聚焦显微镜显示，它们共同表达并定位于CHO细胞中，在SPAG16L的C-端发生相互作用，而SPAG16L的N-端包含一个卷曲螺旋结构，不能和TSSK2相互作用。在体外实验中，SPAG16L可被TSSK2进行磷酸化作用。在大多数没有SPAG16L的老鼠睾丸中，TSSK2表现出缺失和显著性降低。实验结论表明，SPAG16L是TSSK2的酶作用底物。由此可见，TSSK2直接影响了SPAG16L发生磷酸化，间接影响了精子的发生和运动。

Xu等的研究表明[31]，在鞭毛形成过程中，减数分裂后TSSK2集中定位于精细胞的中心体中，除了定位于中心体中，TSSK2还定位于鼠类附睾内精子的尾部和顶体部，定位于人类精子的赤道段，颈部和中段部。TSSK2/TSKS是第一对被发现其定位于精细胞的中心粒和精细胞中的激酶/底物。研究结论是，当TSSK2/TSKS单倍剂量不足，将导致雄性不育，由此可见，在精子形成过程中，特别是鞭毛形成的阶段，TSSK2扮演着不可或缺的作用。

精子的生成机制极其复杂，参与调节精子发生的基因也很多，其调节通路繁多，而且各个蛋白相互作用，存在交叉点，选取主要的通路或是关键交叉点进行研究，研究重要蛋白相互作用（如SPAG6与S-SOX5，Meig1与Parkin，SPAG16L与TSSK2等）是我们今后研究的重点，下一步我们课题组准备从各通路相互作用入手深入研究精子生成缺陷机制，为治疗精子生成障碍等相关疾病提供新思路。

致谢：本课题受国家自然科学基金（81172462）、（81300536）、（81302401）及湖北省自然科学基金（2012FFB04904）、（2013CFB331）资助

不育, 男性; 精子相关蛋白; 精子发生

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（2013-11-05收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.04.021

R 698.2