CAⅨ在肾癌中的研究进展

朱德胜 吴海啸 吴汉

CAⅨ在肾癌中的研究进展

朱德胜 吴海啸 吴汉

碳酸杆酶Ⅸ（carbonic anhydraseⅨ，CAⅨ），又称G250、MN，是新发现的碳酸杆酶家族的异构体之一，基本功能为可逆性催化体内水合反应，被认为是肿瘤相关抗原,具有潜在判断肾癌预后作用的分子标记物。笔者现对CAⅨ在肾癌诊断、治疗及预后判断中的应用作一综述。

1 CAⅨ结构及功能

1.1 CAⅨ结构与分布 CAIX最早发现于人宫颈癌HeLa细胞系，Oosterwdk等[1]于1986年首次在肾癌中发现CAⅨ特异性的表达,其后发现该蛋白有与碳酸酐酶(CA)相似的结构，并被确认为是一种碳酸酐酶的异构酶，命名为CAIX（又称G250、MN）。CAIX是一种位于细胞膜表面的糖蛋白，由酸性氨基酸组成的蛋白质，相对分子质量为58/54KD，由459个氨基酸构成，分别构成细胞内区、跨膜区和细胞外区3部分。细胞外区又分为蛋白多糖区（PG）和碳酸酐酶区（CA）两部分。

人类CAⅨ基因位于9p12.13,共含有10 898个碱基。CAⅨ的抗体为M75和NB100-417，两者在免疫组织化学方法中证实效价相当[2]。近来应用免疫组化的方法发现CAⅨ在多种肿瘤组织中有表达，而在正常组织中仅限于胃黏膜和胆管上皮细胞等有少量表达。姜耀东等[3]成功从肾透明细胞癌中提取DNA完成G250基因克隆测序分析，为蛋白纯化提供了实验依据。研究表明，90%以上的肾癌原发灶有CAⅨ表达，尤其是透明细胞癌全部有表达，88%的转移灶有该抗原表达，因此CAⅨ具有良好的肿瘤特异性，是较理想的肿瘤标记物和肾癌治疗靶点[4]。

1.2 CAⅨ的功能 CAⅨ是碳酸杆酶家族中的一员，为含金属离子Zn+酶，基本功能为可逆性催化体内水合反应，使二氧化碳催化水合成碳酸氢盐和氢离子（CO2+ H2O＜=＞HCO3-+H+），但其确切功能还有待进一步研究。在正常组织中表达的CAⅨ可能与以下3点功能有关：（1）调节细胞外的酸环境，维持电解质和酸碱平衡；（2）CAⅨ细胞表面有活性位点，为各种催化生理活动中提供H+或HCO-3；（3）需要HCO3-的生物合成反应活动中，比如电解质的分泌、骨的溶解与钙化、脂肪形成、糖异生等。在肿瘤细胞中除上述功能可能还与以下功能有关：（1）使肿瘤细胞适应缺氧环境而存活；（2）阻止肿瘤细胞吸收弱碱性化学治疗药物，对化学药物产生耐受；（3）存在致癌基因样特征，在调控细胞增殖、转化方面有重要的作用，可诱导恶性表型。

2 CAⅨ与肿瘤免疫

2.1 CAⅨ的表达 CAIX的表达是由缺氧诱导因子-1（HIF-1）转录合成的，在多数肿瘤细胞表面表达，但在大多数正常的组织中不表达。Lieskovska等[5]在体外研究发现内环境中的某些细胞因子可诱导CAⅨ的表达。Wykoff等[6]在体外缺氧诱导下，发现膀胱癌、子宫颈癌、肺癌等恶性肿瘤细胞中均发现有CAⅨ的表达。VHL基因在对CAⅨ的表达似乎有关键作用，在VHL突变的肾透明细胞癌细胞中发现表达率高，当引入野生型VHL基因到同样的肾癌细胞株，可以发现CAⅨ在正常氧供环境中下调表达，在缺氧环境中诱导上调表达。CAⅨ基因启动子中包含缺氧应答因子，且由HIF-1激活[6]。CAIX的表达已经被证实由转录因子即HIF-1α控制[7]。在正常氧供情况下，HIF-1α羟基化，通过与VHL蛋白（pVHL）结合的遍在蛋白化(作用)阻止形成活化的HIF-1α-HIF-1β复合物。在缺氧环境中，HIF-1α与pVHL结合受到抑制，HIF-1α与HIF-1β形成复合物，活化下游转录合成CAⅨ[8]。CAⅨ的表达与VHL蛋白密切相关，而在肾透明细胞癌患者常常存在VHL突变，因此在肾透明细胞癌患者中均发现有CAⅨ的表达[9]。Shin等[10]认为，其他恶性肿瘤，如子宫颈癌、肺癌、膀胱癌等，CAⅨ表达也是由缺氧诱导形成。在正常组织和肿瘤组织，CAⅨ的表达存在差别。免疫组织化学和RNA印迹技术表明在正常组织呈非常局限的表达，胃黏膜、胎儿的肺组织以及肌肉组织中有适量的表达，更多散在表达在小肠、胆道系统及男性生殖系统。相反，一项研究发现CAIX的mRNA在肾癌细胞中被大量发现[11]。Bui等[12]用CAⅨ的单克隆抗体行免疫组织化学方法检测肾癌组织标本，发现90%以上的肾癌患者表达CAⅨ，且这种表达随着病理分级的提高而降低。

2.2 CAⅨ与肾癌肿瘤免疫 肾癌细胞在快速生长的过程中会产生局部低氧区域，多个临床研究表明肾肿瘤细胞对放射治疗或化学治疗不敏感与低氧有关。实验表明，低氧可能促进肿瘤的远处转移[13]，低氧与远处转移的关系在子宫颈癌和软组织肉瘤中已得到证实[4,14]。充足的组织细胞营养供给是保持细胞生理功能的基础，肾癌细胞代谢旺盛，组织细胞氧供与消耗失去了平衡，通过血管再生可能是肿瘤获得氧气和能量的一个重要途径。无氧代谢是另一个重要途径，肾癌细胞在缺氧的环境中通过无氧代谢产生大量丙酮、乳酸等酸性代谢产物使内环境呈酸性。CAⅨ在肾癌细胞中的存在提示可以通过跨膜质子转运调节细胞内的pH值使在酸性环境中存活[15]。

3 CAⅨ与肾癌治疗

3.1 肾癌治疗现状 肾癌被认为是免疫性肿瘤，它对化疗、放疗均不敏感[16]，所以目前手术治疗仍是主要的治疗手段。对于有转移的进展期肾癌，免疫治疗是除外科手术外的重要治疗方法，目前主要应用的是IL-2和INF-α。IL-2是美国FDA批准的用于晚期肾癌治疗的细胞因子，也是目前国内外公认的治疗进展期肾癌的一线用药之一。但目前的临床研究表明干扰素、IL-2在进展期肾癌中的治疗作用有限。国外大量临床随机对照研究报道，单用IFN-α治疗转移性肾癌其有效率仅10%～20%。IFN-α和IL-2联合并未显示出明显优越性[17]。2011年中国泌尿外科肾癌指南指出，虽然IFN-α联合IL-2可提高对转移性肾细胞癌治疗的有效率，但单独应用或者联合应用均不能延长术后患者的总生存期和疾病无进展生存期。

目前靶向药物在进展期肾癌中的疗效得到肯定，推荐舒尼替尼、索拉非尼分别作为治疗进展期肾癌的一线和二线治疗用药[18]。然而在临床中发现部分肾癌患者对靶向治疗药物疗效差甚至无效。在肾癌术后的药物治疗中，不管使用免疫治疗、靶向治疗，均无合适的方法挑选出药物治疗效果最佳患者，在临床上迫切需要1种或几种方法来判断最适合相应治疗方案的患者，而CAⅨ是很有潜力的判断因子。

3.2 CAⅨ与肾癌的治疗 肾癌CAⅨ的特异性表达在以下治疗方法上提供了基础：（1）细胞因子介导的免疫治疗；（2）抗体介导的放射免疫治疗；（3）CAⅨ为靶点的靶向治疗。Ramsey[19]研究发现，不管在局限性还是在转移性肾癌，CAⅨ的表达均提示对IL-2和IFN-α治疗的反应性。2005年，Atkins等[20]通过对66例接受IL-2治疗的患者观察，发现CAⅨ表达阳性患者反应率达78%（21/ 27），而阴性患者只有51%（20/39），且CAⅨ表达阳性的患者中位生存期显著延长达到5年以上。因此，CAⅨ的表达可能被用于转移性肾癌的分层，并针对不同级别的转移性肾癌采用相应治疗方案。

目前肿瘤疫苗的策略是增强抗原的加工呈递，在转移性肾癌中，应用带标记的单克隆抗体（G250 mAb）和CAⅨ致敏的树突状细胞的治疗效果还处于临床试验Ⅰ期或Ⅱ期。齐桓等[21]证实CAⅨ致敏的树突状细胞瘤苗体外可有效的诱导特异性抗肾癌细胞效应。Lamers等[22]联合IL-2利用鼠源性单克隆抗体制备的T细胞治疗CAⅨ表达阳性肾癌患者获得满意效果。

自从靶向药物应用于转移性肾癌的治疗后，其效果惊人，但Molina[23]发现，部分肾癌患者对靶向治疗药物无效，可能与肿瘤不依赖靶向药物作用点如VEGE等有关。由此推断，在靶向药物作用点的上游因素如封闭HIF-1α，削减CAⅨ对肿瘤的细胞内环境的适应能力，结合免疫治疗可能进一步提高靶向药物的疗效[23]。Choueiri等[24]对118例不同组织学类型患者研究发现，相对于舒尼替尼，CAⅨ阳性的患者对索拉非尼具有更好的反应性，且透明细胞亚型较其他组织学亚型具有更明显的肿瘤缩小率。Osunkoya等[25-27]的研究发现，免疫组化及PCR方法均证实CAⅨ在透明细胞组织亚型中表达最高，与之前的研究结果一致。目前CAⅨ在靶向治疗中的作用还缺少多中心大样本研究，根据CAⅨ的表达情况选择不同的靶向药物可能是今后研究重点。

利用131I标记的CAⅨ单克隆抗体（M75/NB100-417）行放射免疫治疗，使抗体靶向聚集杀伤表达CAⅨ阳性的肾癌细胞，为肾癌靶向治疗提供另一个突破点。Brouwers等[28]已经证实，通过2个放射免疫治疗周期可以有效阻止转移性肾透明细胞癌的进展，但在其他病理类型中的疗效还有待进一步明确。

4 CAⅨ在肾癌的诊断及预后判断的作用

4.1 CAⅨ与肾癌的诊断 利用核素标记的针对CAⅨ的单克隆抗体（G250 mAb）进行肿瘤放射免疫显像，有望用于肾癌的早期诊断及分期。使用124-I标记的CAⅨ抗体（G250 mAb）行PET检查能够准确判断肾透明细胞癌，Divgi等[29]在一期临床试验中发现此检查的敏感性、特异性分别达到94%、100%。

4.2 CAⅨ与肾癌的预后关系 多数学者研究认为，通过检测肾癌术后CAⅨ的表达，可以更准确的判断预后。高表达CAⅨ通常提示良好的预后，CAⅨ表达阳性率与肾癌的良好预后呈正相关，并且提示对系统治疗具有更好的反应性。CAⅨ阳性表达可能改善了肾癌细胞中的缺氧环境，降低肿瘤远处转移的能力。Takacova[30]发现随着病理分级的增加，CAIX的阳性率逐渐下降（50%T1 vs 17%T3）。Patard[31]通过对100例肾癌患者进一步研究证实，低表达CAIX和VHL基因的突变是独立预后因素。Martino[32]对52例转移性肾癌研究发现，高表达CAIX的肾癌患者具有更长的中位生存期（25.5个月vs8.5个月）和更好的IL-2治疗反应性（37%vs 8%）。但Leibovich[33]通过对730例肾透明细胞癌患者研究并未得出上述结论。虽然单因素分析时，低表达CAⅨ与肾癌病死率相关，当结合肿瘤坏死、核级等多因素分析时，CAⅨ与肾癌死病率不存在相关性。导致与前几项研究完全不同的结果可能有两个原因：第一，在患者数量及构成比例上不同，本研究转移性肾细胞癌只占11%，而其他研究达40%～60%；第二，免疫组织化学分析方法不同，本研究中使用微点阵方法而不是定量分析方法。多数研究认为，CAIX是一个独立的肾癌标志物，低表达与肾癌的病死率呈正相关。

5 展望

在原发性肾透明细胞癌中，CAⅨ的表达是肾癌患者术后生存的预后因素，且能预测对IL-2治疗的反应性。临床上发现部分肾癌患者对靶向药物无效，CAIX的表达水平是否和耐药性相关还需要进一步研究。未来有望利用核素标记的G250 mAb进行肿瘤放射免疫显像、放射免疫治疗以及肿瘤疫苗的研究。根据CAIX筛选出免疫治疗及靶向治疗反应性好的肾癌患者，根据不同患者个体化选取经济、高效、毒副反应小的系统治疗方案可能是今后研究的重点。

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2013-03-10）

（本文编辑：欧阳卿）

321000 金华市中心医院泌尿外科

吴海啸，E-mail：whxmjwz@yahoo.com.cn