人巨细胞病毒感染与系统性红斑狼疮的相关性

陈静，章慧娣，楼威洋，邵蓉蓉，张丽芳，薛向阳，朱小春

（1.温州医科大学附属第一医院 风湿免疫科，浙江 温州 325015；2.温州医科大学附属第一医院肾内科， 浙江 温州 325015；3.温州医科大学 第一临床医学院，浙江 温州 325035；4.温州医科大学 微生物学与免疫学教研室，浙江 温州 325035）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种累及全身多系统、多脏器的自身免疫性疾病[1]，其病因及发病机制尚未明确。近年来的研究显示，病毒感染，如EB病毒、细小病毒B19等是SLE发生发展的重要促进因素[1]。但人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）感染与SLE的相关性目前仍存在争议。有研究认为HCMV的感染可能为SLE的一个重要病因，并加重SLE疾病的进程[2]，同时，SLE病情的严重也可能导致HCMV的感染[3]，两者互为因果。但有些研究认为HCMV感染与SLE无关[4]。考虑到人群高感染率的HCMV具潜伏感染和广泛细胞亲嗜性的特征，不同检测方法可明显影响HCMV检测结果。为此，本研究通过血清HCMV特异性IgG、IgM检测分析SLE患者及健康体检者HCMV感染的同时，选择HCMV必不可少的UL55基因以及潜伏相关的、高度保守的，且只在临床分离株中存在的UL138基因，建立高度敏感特异的PCR方法，分析SLE患者及健康体检者外周血白细胞内HCMV感染状态，多层面评价HCMV感染与SLE的相关性。

1 材料和方法

1.1 一般资料 本研究共计收集自2011年3月至2012年5月间在温州医科大学附属第一医院住院治疗的SLE患者抗凝外周静脉血标本60例，其中男15例，女45例，年龄11～70岁，平均（34.17±12.80）岁。所有SLE患者均进行了常见临床症状调查、常见检测指标的测定，并根据国际通用的SLE疾病活动指数（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）[5]进行评分，一般认为≤5分为非活动期，＞5分为活动期。另选取同一时期本院健康体检者（均排除SLE）抗凝外周静脉血标本111例，其中男41例，女70例，年龄18～55岁，平均（32.68±10.43）岁。两组人群均排除乙肝、丙肝、人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、梅毒、EB病毒（epstein-barr virus EBV）等感染。本研究经本院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 试剂 KOD Plus Neo[东洋纺（上海）生物科技有限公司]；100 bp DNA marker[天根生化科技（北京）有限公司]；DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]；红细胞裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）；pEASY-Blunt Zero Cloning Vector[天根生化科技（北京）有限公司]；HCMV IgG检测试剂（德国罗氏诊断有限公司）；HCMV IgM检测试剂（德国罗氏诊断有限公司）。引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 外周血白细胞分离：取当天采集的SLE患者及健康体检者的EDTA抗凝静脉血（2 mL），4 ℃1 500 r/min离心10 min，吸去上层血浆，向下层的血细胞悬液中加入3倍体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，充分裂解20 min，4 ℃ 3 000 r/min离心20 min，弃上清。用PBS重悬下层的白细胞沉淀4 ℃ 3 000 r/min离心10 min，弃上清，以便彻底清除红细胞，重复清洗两次。

1.3.2 基因组DNA抽提：采用DNA提取试剂盒抽提外周血白细胞的DNA，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA纯度。

1.3.3 PCR检测外周血白细胞中HCMV UL55和UL138基因：采用巢式PCR技术检测SLE患者及健康体检者外周血白细胞内HCMV UL55和UL138基因。UL138基因及UL55基因检测的引物序列[6]及反应条件见表1。第二轮PCR反应体系以1μL第一轮PCR扩增产物为模板进行扩增。阳性对照为确诊HCMV感染患者的DNA，阴性对照为灭菌的双蒸水。UL55及UL138的PCR产物大小分别为100 bp和89 bp。目的条带连接pEASY-Blunt Zero Cloning Vector，挑阳性克隆测序。

表1 巢式PCR引物及反应条件

1.3.4 血清HCMV特异性IgG和IgM检测：收集SLE患者及健康体检者对照血清，按血清HCMV IgG、IgM检测试剂说明书操作检测血清中HCMV IgG和IgM（委托某医院检验科代为检测）。

1.4 统计学处理方法 采用SPSS17.0软件进行统计学分析。计数资料用 ±s表示，采用独立样本t检验进行比较；分类资料用n/%形式表示，采用卡方检验及Fisher确切概率法比较不同方法检验HCMV感染的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞内HCMV UL55、UL138 PCR检测方法的建立 以SLE患者及健康体检者外周血白细胞中抽提的DNA（浓度测定范围在408.1～510.6 ng/μL）为模板进行巢式PCR扩增（第1泳道为阳性对照，最后一个泳道为阴性对照），PCR产物琼脂糖凝胶电泳显示，分别在100、89 bp位置出现单一的目的条带（见图1A-B），分别将其切胶回收后连载体送测序，测序结果与目的序列吻合（见图1C-D），说明建立的PCR方法可用于检测外周血白细胞的HCMV感染。

2.2 SLE患者及健康体检者HCMV感染不同检测方法阳性率的比较 60例SLE患者及111例健康体检者外周血白细胞内HCMV UL55、UL138基因检测及血清HCMV IgG、IgM结果显示，SLE患者外周血白细胞内HCMV UL55、UL138及血清HCMV IgG、IgM阳性率分别为43.33%、96.67%、100%和6.67%，健康体检者外周血白细胞内HCMV UL55、UL138及血清HCMV IgG、IgM阳性率分别为1.80%、100%、100%和0.90%。SLE患者与健康体检者外周血白细胞内HCMV UL138基因及血清HCMV IgG检测阳性率两组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；SLE患者外周血白细胞内HCMV UL55基因检测阳性率高于健康体检者（P＜0.01）。

2.3 HCMV不同检测方法相关性分析 比较外周血白细胞内HCMV UL55、UL138检测和血清HCMV IgG、IgM检测结果显示，细胞内HCMV UL138检测与血清HCMV IgG检测存在较好的一致性，两种方法同时检测阳性率达98.83%；细胞内HCMV UL55及UL138检测间一致性较差，两种检测同时阳性率仅15.79%（见表2）。

图1 外周血白细胞HCMV UL55、UL138 PCR检测及测序结果

表2 HCMV不同检测方法阳性率的比较

2.4 外周血白细胞内HCMV感染检测与SLE患者免疫系统相关指标的相关性分析 对外周血白细胞内HCMV UL55检测结果与SLE患者临床特征及免疫系统相关指标进行相关性分析发现，与外周血白细胞内HCMV UL55阴性的SLE患者相比，细胞内HCMV UL55阳性患者的抗Rib-P抗体（P=0.031）、直接Coomb’s试验（P=0.017）阳性率明显升高，血清总IgG（P=0.023）、β2-GP-1（P=0.022）水平明显升高，抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）、抗ds-DNA抗体、抗U1RNP抗体、抗组蛋白抗体、抗SSA抗体、抗SSB抗体阳性率及SLEDAI评分等指标差异无统计学意义（均P＞0.05）。细胞内HCMV UL138检测结果与SLE患者免疫系统相关临床指标差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表3。

表3 不同HCMV感染检测情况与SLE患者临床指标的相关性分析（n=60，n/%， ±s）

3 讨论

HCMV属于疱疹病毒β亚科，是一种广泛细胞亲嗜性的DNA病毒，能感染上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、外周血单个核细胞及神经细胞等。人群HCMV感染十分普遍，据报道中国成人感染率高达95%[7]，与本研究结果相符。关于SLE与HCMV感染相关性研究近年来的研究证据表明HCMV的感染是SLE重要促发因素，并加重SLE疾病的进程[1]。研究发现，与正常对照比较，SLE患者HCMV感染阳性率以及体内HCMV DNA拷贝数明显升高[8]；大部分的SLE患者血液中存在HCMV PP65 C末端的抗体[9]；此外，核内U1小核糖核蛋白（U1 snRNP）抗体多见于SLE患者以及HCMV感染或免疫接种的动物体内或血液中[10-11]。但James等[4]研究认为HCMV感染与SLE无关。而且SLE患者HCMV感染率不同的报道也存在较大差异：Takizawa等[12]利用PP65抗原检测风湿病患者中HCMV的感染情况，总共151例患者中有149人感染，其中SLE患者74例全部感染HCMV，感染率达100%；Newkirk等[10]使用ELISA试剂盒检测HCMV抗体，SLE患者HCMV感染率约为60%，与正常对照组相近；Su等[13]通过对类风湿因子（RF）中和处理后，87个SLE患者中有84例CMV-IgG阳性（阳性率为96.55%），9例CMV-IgM阳性（阳性率为10.34%）。由于HCMV基因组上存在165～252个开放阅读框（open reading frames，ORF），而且潜伏感染是HCMV重要生物学特征[14-16]，所以选择不同检测基因、采用不同检测手段均可能导致HCMV检测结果的变化。

目前对于HCMV的检测方法主要有病毒分离、PP65抗原检测、血清IgM、IgG抗体检测、核酸检测等方法。HCMV诊断的金标准是HCMV分离培养，但是HCMV在体外人成纤维细胞培养中增殖非常缓慢，复制周期为36～48 h。HCMV初次分离培养，需1个多月才出现特殊的细胞，而且操作繁琐，设备要求高，即使分离结果阴性并不能完全排除HCMV活动性感染，因此不适于作为检测HCMV感染的常用方法。现在临床上HCMV感染的诊断主要依赖于抗体血清学（IgG、IgM）检测或血清抗原（PP65）检测。但HCMV感染细胞谱广泛[17]，血清学诊断难以明确感染部位，且经过激素和/或免疫抑制剂治疗后，HCMV感染可能不出现或延迟出现IgM类抗体反应。由于PCR技术敏感性高，已被广泛应用于HCMV感染检测。可用于PCR检测的HCMV靶基因有：pp65基因[18]、UL54[19]、UL83[20]、UL123[21]、US17基因[22]、UL75[23]等。已有文献报道编码糖蛋白B（gB）的UL55基因是HCMV一个不可缺少的、高度保守的基因[24]，而UL138是HCMV潜伏感染所必需的高度保守的基因[25]。为更好地反映SLE患者HCMV感染情况，我们不但进行血清HCMV IgG和IgM检测，而且建立细胞内HCMV UL55及UL138巢式PCR技术以检测外周血白细胞内HCMV感染。PCR产物电泳及测序结果证实我们建立的巢式PCR能特异性检测到外周血白细胞内HCMV UL55及UL138基因。

在血清HCMV IgG、IgM及细胞内HCMV UL55、UL138四种不同HCMV检测方法中，不管是SLE患者还是健康体检者，血清HCMV IgG及细胞内HCMV UL138基因检测几乎全部阳性，细胞内HCMV UL55基因检测其次，血清HCMV IgM检测阳性率最低。比较SLE患者与健康体检者检测结果，血清HCMV IgG及细胞内HCMV UL138基因检测结果之间差异无统计学意义（P＞0.05），SLE患者血清HCMV IgM检测阳性率高于健康体检者，但差异无统计学意义（P=0.052），SLE患者外周血白细胞内HCMV UL55基因检测的阳性率显著高于健康体检者（P＜0.01）。HCMV感染4种检测方法的相关分析显示，细胞内HCMV UL138检测与血清HCMV IgG检测存在较好的一致性，而同为细胞内HCMV感染检测，由于UL55及UL138目的基因选择不同，HCMV检测感染阳性率之间存在显著性差异。这些结果提示，不同检测基因、不同检测手段均可能影响HCMV检测结果。

进一步分析外周血白细胞内HCMV感染检出情况与SLE患者免疫系统相关指标间的相关性，以细胞内HCMV UL55基因作为HCMV感染指标，HCMV感染与SLE患者多项免疫系统相关指标存在相关性，如抗Rib-P抗体、直接Coomb’s试验、血清总IgG、β2-GP-1等，但是以细胞内HCMV UL138基因作为HCMV感染指标，HCMV感染与SLE患者免疫相关指标没有相关性。因此，HCMV感染与SLE存在一定的相关性，但由于本研究仅从HCMV感染的阳性率方面进行评价，并未深入探究SLE患者疾病活动期与缓解期以及其临床指标与HCMV拷贝数的关系，且样本量偏少，未进一步研究HCMV活动性感染和潜伏期对SLE患者疾病情况的影响。因此，HCMV感染与SLE之间相互作用的机制有待于进一步探索。

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