壳聚糖对奶牛人工瘤胃温室气体排放的影响

张 静，李倜宇，史彬林，闫素梅，娜仁花，红 雷，郭晓宇

（内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特010018）

全球气候变暖受到了国际社会的普遍关注，其主要原因是人类活动排放了大量的二氧化碳（CO2）、甲烷（CH4）和氧化亚氮（N2O）等温室气体，而畜牧业是温室气体排放的一个重要来源。在畜牧业中，随着我国奶牛养殖业的飞速发展，奶牛排放的温室气体增长最快，1980～2009年间增加了21.78倍［1］，奶牛甲烷排放量达到了动物排放总量的19.38%。据估测，奶牛约94% 的甲烷是由瘤胃产生的［2］，这不仅导致了气候变暖，而且造成饲料能量的损失［3］。虽然甲烷在大气中的含量比二氧化碳的含量少，但其温室效应是二氧化碳的23倍，而且甲烷在大气中的寿命也比二氧化碳短，可见对甲烷减排要比控制二氧化碳在缓解温室效应方面更快更容易。据相关统计估算，到2030年甲烷对全球气候变暖的贡献率可能达到50%，将成为头号温室气体［4］。因此，减少奶牛瘤胃内甲烷的生成对提高饲料能量利用率和改善环境具有双重意义。所以，研究和开发具有降低奶牛温室气体排放的绿色饲料添加剂是非常必要的。目前，壳聚糖作为自然界中唯一的碱性多糖，具有多种生物活性，可增强动物免疫力，提高生产性能，抑制细菌、霉菌的生长活性，同时在医药、化工、食品等方面也有广泛的用途［5］。有研究结果显示，壳聚糖在一定程度上可改善瘤胃能量发酵，从而减少甲烷的排放量［6］。但相关研究报道甚少，本试验利用体外培养技术，研究添加不同水平的壳聚糖对奶牛人工瘤胃温室气体排放的影响，为壳聚糖在奶牛生产中的科学应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及人工唾液的制备

本试验所用壳聚糖购于山东济南海德贝海洋生物工程有限公司，黏度为45cps，脱乙酰度为85.09%。瘤胃液是在健康的荷斯坦奶牛经屠宰后，立即采集不同位点瘤胃内容物约600mL，经4层纱布过滤后，将滤液放入通有CO2并预热达39 ℃的保温瓶中，备用。

人工唾液由常量元素溶液、微量元素溶液、缓冲溶液、指示剂溶液和还原性溶液配制而成。各种溶液的配制方法见表1［7］。人工唾液的配制方法为：按顺序将400mL 蒸馏水，200mL A 液，0.1mL B液，200mL C 液和1.0mL D 液加入广口瓶中，并将广口瓶放入39℃恒温振荡水浴锅中，最后加入40 mL还原性溶液，整个过程持续通入CO2，培养液颜色由蓝色逐渐变为红色再到无色，此时表示已达到厌氧条件即可使用。

表1 人工唾液中各单一溶液配方Table 1 Formula of each single solution in artificial saliva

1.2 试验设计

采用注射器式培养系统体外模拟瘤胃发酵（Menke，1979）［8］。试验分为1 ～12h和13～24h两个时期，设置5个处理，每个处理6个重复，分别添加0%、0.3%、0.6%、1.2% 和2.4% 的壳聚糖。各处理组的培养底物均为0.5g，基础底物组成相同，其中精料占40%，苜蓿占44%，羊草占16%。

表2 发酵底物组成及营养水平（风干基础）Table 2 Composition and nutrient levels of fermentation substrate（air－dry basis）

1.3 试验方法

将人工唾液与瘤胃液（人工唾液∶瘤胃液＝2∶1）混合配成人工瘤胃培养液，抽取60mL 人工瘤胃培养液加入每个装有底物样品并在39 ℃下预热后的培养瓶中，然后持续向培养瓶内充CO2气体4～5 min后，盖紧橡胶瓶塞，放入39 ℃恒温振动速度为40r／min水浴摇床中厌氧培养24h。

1.4 测定指标

试验开始后，每隔2h用20mL 密封且润滑性良好的注射器将培养体系产生的气体测定一次，每次记录完后放气，使注射器的刻度归零，将测定结果进行累计得到12和24h 反应体系中的总产气量。用胶带固定10mL注射器针筒与活塞芯杆的位置，每隔2h抽取1.5mL气体，12h换一只注射器，分别在培养时间12和24h累计采集9mL气体，用Agilent 6890A 气相色谱仪（美国）测定气样中CH4、CO2及N2O的质量浓度，然后分别乘以相应培养时间的总产气量计算得出CH4、CO2及N2O产生量。

2 结果与分析

2.1 添加不同水平壳聚糖对1～12h人工瘤胃温室气体排放的影响

由表3可见，1～12h，各壳聚糖处理组CH4的产量均低于对照组。从回归统计结果得出，人工瘤胃中CH4的产气量随壳聚糖添加剂量的升高呈现一次线性降低趋势（P＝0.074），以添加1.2% 壳聚糖组的CH4产量最低。人工瘤胃中CO2，N2O 的产量与壳聚糖的添加量没有显著的剂量依赖关系（P＞0.05）。

表3 添加不同水平壳聚糖对1～12h人工瘤胃温室气体排放的影响Table 3 Effect of different dietary chitosan on the greenhouse gas emission during 1～12h

2.2 添加不同水平壳聚糖对13～24h人工瘤胃温

室气体排放的影响

不同水平壳聚糖对13～24h人工瘤胃温室气体排放的影响见表4。从表4可见，13～24h，各壳聚糖处理组CH4的产量均低于对照组，从回归统计结果得出，随壳聚糖添加剂量的升高，各培养瓶中CH4的产量呈现显著的一次线性（P＝0.05）降低，而培养体系中CO2和N2O 的产量变化不显著（P＞0.05）。从方差统计结果得出，添加0.6%、1.2%、2.4%的壳聚糖处理组CH4产量显著低于对照组，并且添加1.2%的壳聚糖处理组效果最好。

表4 添加不同水平壳聚糖对13～24h人工瘤胃温室气体排放的影响Table 4 Effect of different dietary chitosan on the greenhouse gas emission during 13～24h

3 讨论

反刍动物瘤胃主要靠寄居其内部大量的细菌、原虫和厌氧真菌等微生物来消化各种饲料。有学者研究发现，反刍动物瘤胃中82%的甲烷是通过数种甲烷菌以H2和CO2为底物进行还原反应生成的［9］，可见瘤胃内CH4的生成与产甲烷菌的活性有关［10］。本试验采用人工瘤胃法体外模拟反刍动物的瘤胃来探究壳聚糖对奶牛瘤胃温室气体排放的影响，此方法不仅可以比较准确地探究饲料添加剂的作用效果，而且此方法具有低成本，易控制等优点［11］。本试验结果表明，添加适宜剂量的壳聚糖可以降低人工瘤胃中CH4的产量，其原因可能是由于壳聚糖分子中的－NH3＋带正电性，可吸附在产甲烷菌细胞的表面或通过渗透进入细胞内，扰乱细胞正常的生理活动［12］，从而降低了产甲烷菌的活性。

有学者研究了壳聚糖对瘤胃甲烷产生及发酵特性的影响，结果表明，人工瘤胃中添加1500 mg的壳聚糖，厌氧培养9d（7d适应期和2d采样期）可以显著降低羯羊人工瘤胃中甲烷的产量［13］。另有学者利用人工瘤胃长期系统（Rusitec系统）体外培养96h研究发现，添加1380mg的壳聚糖可以降低人工瘤胃长期系统中甲烷的产量［14］。以上研究结果都与本试验的结果一致，说明添加适宜剂量的壳聚糖可在一定程度上降低瘤胃CH4的产量，从而影响瘤胃温室气体的排放，缓减对环境的温室效应，但其确切的作用机制尚不清楚，还需进一步探究确定。

4 结论

通过本试验初步得出：人工瘤胃中添加壳聚糖可以降低CH4的产量，且以添加1.2%壳聚糖的效果较好。该结果提示，在奶牛日粮中添加适宜剂量的壳聚糖可在一定程度上缓解大气的温室效应。

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