牛A－FABP与SREBP1基因的组织表达规律研究

张 乐，彭 燮，刘 扬，付常振，王洪宝，2＊，昝林森，2＊

（1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100；2.国家肉牛改良中心，陕西杨凌712100）

牛肉是我国传统的高档消费肉类制品，具有瘦肉多、脂肪少、蛋白高、胆固醇低等特点，其必需氨基酸含量均衡，具有较多的维生素和微量元素，是人类理想的食品之一［1］。衡量牛肉品质的一个重要指标是牛肉的大理石花纹含量。大理石花纹含量的多少主要由肌肉脂肪含量的多少决定。

脂肪酸结合蛋白（fatty acid－binding proteins，FABPs）参与脂类代谢和脂肪的沉积的调控，它的表达与肌内脂肪含量有密切联系。尤其是脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因（adipocyte fatty acid－binding protein，A－FABP），研究表明A－FABP只在脂肪中表达，对于脂肪的沉积可以在不同水平起到一定的调控作用［2－5］。Briggs等（1993）从Hela 细胞核中抽提纯化出来的一种蛋白，它能够和固醇调节元件蛋白相结合，故称为固醇调节元件结合蛋白，即SREBP。它是动物体内脂肪合成的一个极重要的调节因子，通过调节动物体内与脂肪生成相关的酶（生脂酶）的基因转录水平而调节这些酶的活性，从而控制体内脂肪合成。大量研究己经证实，SREBPs在脂肪合成基因的营养调控中有着极其重要的作用［6－8］。

秦川牛是我国著名的地方黄牛品种，肉役性能突出，遗传稳定，适应性强，但也同时存在生长速度较慢、脂肪沉积能力较弱等不足之处［9］。大连雪龙黑牛是以辽宁本地黄牛为基础，通过引进利木赞和日本和牛进行三元杂交而成的优质肉牛杂交组合［10］，其脂肪沉积能力强，肉质鲜嫩，饱和脂肪酸低、胆固醇含量也低、不饱和脂肪酸高［11］。因此，揭示秦川牛与雪龙黑牛脂质代谢的分子调控机制，可为应用分子育种技术加快秦川牛的肉用选育和改良奠定基础。

本研究利用qRT－PCR 检测A－FABP基因和SREBP1基因在牛体内不同组织中的表达特性，以及揭示这两个基因在脂肪沉积能力存在显著差异的秦川牛和雪龙黑牛脂肪、肌肉和肝脏组织中的表达差异，为优质肉牛品种的选育奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

国家肉牛改良中心种质资源库－80℃保存的3月龄荷斯坦牛心脏、脾脏、肝脏、肺、肾、肌肉、脂肪、瓣胃、网胃、皱胃、瘤胃、大肠、小肠等13种组织，用于分析A－FABP和SREBP1的表达规律。

3头30月龄左右大连雪龙黑牛阉牛和3头30月龄秦川牛阉牛肌肉、脂肪、肝脏用于比较AFABP和SREBP1在脂肪沉积能力存在显著差异的肉牛中表达差异。

1.2 RT－PCR

1.2.1 不同品种牛组织总RNA 的提取和反转录

使用TRIzol法提取组织RNA（按照说明书操作），并用琼脂糖凝胶电泳检测法和分光光度计检测法进行质量检测。将符合要求的所提取的组织总RNA 用PrimeScript RT Master Mix反转试剂盒进行反转录（总体积40μL∶8μL PrimeScript RT Master Mix，2μg总RNA，用RNase free dH2O 补足40μl），反转录程序：37 ℃，15min；85 ℃，5s；4℃（反应需在冰上进行）。得到的cDNA 置于－20℃冰箱冷冻保存。

1.2.2 引物设计 PCR 扩增所用引物全部根据GenBank 提供的有关mRNA 序列用PrimerPremier（5.0版）自行设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 实时定量PCR 引物信息Table 1 Primers for genes

1.2.3 实时荧光定量技术 使用SYB®Premix Ex TaqⅡ试剂盒（TakaRa 公司产品）进行实时定量PCR，反应总体系为20μL，其中包括SYB®Premix Ex TaqⅡ10μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，ROX Reference Dye（50X）0.4μL，模板2μL，水6μL。在7500Real Time PCR仪（ABI公司产品）上进行反应。PCR循环参数：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火34s，循环40次，进行数据分析。溶解曲线程序为：95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s。

1.3 数据统计

首先将样品设置相同的阈值线（应用SPSS16.0软件计算重复样品间Ct均值及标准偏差），本研究分别以：（1）荷斯坦牛的肝脏组织中目标基因的表达量为标准。（2）用待测候选基因的Ct值减去对应组织内参基因GAPDH 的Ct值就得到每种组织的ΔCt值，选择ΔCt值最大的秦川牛或是雪龙黑牛组织作为标准。采用2－△△Ct方法处理数据［12］，分析得到（1）目标基因A－FABP和SREBP1 在荷斯坦牛13种组织中的表达情况。（2）目标基因A－FABP和SREBP1在秦川牛和雪龙黑牛脂肪、肌肉和肝脏组织中的相对表达量。具体公式为：

ΔCT1＝CTmean（对照组目标基因）－CTmean（对照组GAPDH）

ΔCT2＝CTmean（待测组目标基因）－CTmean（待测组GAPDH）

RQ ＝2－（ΔCT2－ΔCT1）＝2－△△CT

式中：mean代表均值；CTmean（对照组目标基因）指的是对照组目标基因的3个样品的mRNA 平均表达量；CTmean（待测组目标基因）指的是待测组目标基因的3 个样品的mRNA 平均表达量；RQ 值（Relative Quantification，相对定量）表示试验组目的基因的表达相对于对照组变化的倍数。所得到的的基因的相对表达量用SPSS16.0软件进行方差分析，P＜0.05则认为差异显著。

2 结果与分析

2.1 荷斯坦牛A－FABP 和SREBP1基因的组织表达规律分析

以肝脏组织中目标基因的表达量为参照，所有荷斯坦牛组织中目标基因A－FABP相对表达量的分析结果见图1，分析数据可得在3月龄荷斯坦牛13种组织中，A－FABP在脂肪组织中表达量远远高于其他组织，在瘤胃，网胃，瓣胃和肺中有少许表达，其他组织几乎不表达。

以肌肉组织中目标基因的表达量为参照，所有荷斯坦牛组织中目标基因SREBP1的相对表达量见图1，分析数据可知在3月龄荷斯坦牛13种组织中，SREBP1在脂肪组织中表达量最高，在肾，瘤胃和脾脏中有少许表达，其他组织几乎不表达。

2.2 A－FABP 基因在秦川牛、雪龙黑牛的肌肉、脂肪、肝脏中的组织表达规律分析

通过数据分析A－FABP基因在雪龙黑牛和秦川牛的肌肉、脂肪、肝脏中的相对表达量可知如（图2），A－FABP基因在雪龙黑牛肌肉和肝脏组织中的表达量显著高于秦川牛的肌肉和肝脏（P＜0.05），而在脂肪组织中，秦川牛和雪龙黑牛表达量无显著差异（P＞0.05）。

图1 荷斯坦牛A－FABP和SREBP1组织表达差异分析A.A－FABP 基因各组织表达结果；B.SREBP1基因各组织表达结果；1.肌肉；2.脂肪；3.肝脏；4.心脏；5.肺；6.肾；7.脾脏；8.瘤胃；9.网胃；10.瓣胃；11.皱胃；12.大肠；13.小肠Fig.1 A－FABP and SREBP1expression difference in tissues of Holstein cattleChart A displayed the A－FABP gene expression in different tissues；chart B for that of SREBP1gene.1.Muscle；2.Fat；3.Liver；4.Heart；5.Lung；6.Kidney；7.Spleen；8.Rumen；9.Reticulum；10.Omasum；11.Abomasums；12.Large intestine；13.Small intestine

图2 － 基因在秦川牛和雪龙黑牛肌肉脂肪和肝脏组织中的表达比较＊表示差异显著（P＜0.05），＊＊表示差异极显著（P＜0.01）。下同。Fig.2 A－FABP expression difference in muscle，fat，liver in Qinchuan cattle and Snowdragon cattle＊ marked sighificout difference amons given data（P＜0.05）.The same as below.

2.3 SREBP1基因在秦川牛、雪龙黑牛的肌肉、脂肪、肝脏中的组织表达规律分析

SREBP1基因在雪龙黑牛和秦川牛的肌肉、脂肪、肝脏中的相对表达量见图3。通过数据分析可知，SREBP1基因在雪龙黑牛肌肉和肝脏组织中的表达量显著高于秦川牛的肌肉和肝脏，而在脂肪组织中，秦川牛表达量显著高于雪龙黑牛表达量（P＜0.05）。

图3 SREBP1基因在秦川牛和雪龙黑牛肌肉、脂肪和肝脏组织中的表达比较Fig.3 SREBP1expression difference in muscle，fat，liver in Qinchuan cattle and Snowdragon cattle

3 讨论

我国养牛历史悠久，而且具有十分丰富的牛品种资源。然而据调查报告显示，我国牛肉产量虽占世界第三，但出口量却不及国际牛肉贸易量的1%［13］。国内生产的牛肉中优质牛肉所占比重太小，在国际上缺乏竞争力。值得人们关注的是现在的牛肉市场尤其是对口感鲜嫩多汁、大理石花纹丰富，并含有大量人体所需脂肪酸的优质高档牛肉需求量与日俱增［14］。在亚洲，日本、韩国都育成了风味独特、肉质细嫩、各具特色的和牛、韩牛，它们所产牛肉大理石花纹丰富，我国亟待解决的问题是培育优良的肉牛品种［15］。首先需关注我国肉牛品种的肉质性状改良进程，而深层次探索与之相关的基因具有至关重要的意义。据目前研究证明A－FABP与SREBP1对调节脂肪代谢起着重要的作用。因而进一步研究这两种基因在脂肪代谢中的调节规律显然有助于培育优良的高档牛肉品种。

A－FABP是脂结合蛋白超家族的成员［16］。FABPs家族的主要功能是与哺乳动物的脂肪酸代谢有关［17］。目前对A－FABP基因的研究多数集中于对其分子结构的研究上。而其在组织中相对表达量的差异主要在鸡、鸭、猪上。例如，Armstrong等［18］对猪A－FABP基因的组织表达规律进行差异分析，采用Real－Time PCR 方法检测，结果发现AFABP基因都只在脂肪组织中表达。王启贵等［19］选择周龄不同的鸡的肝组织、肾脏组织、心脏组织、肺脏组织、脾脏组织、脂肪组织等15种组织，利用荧光定量PCR 和Northern blot 方法，检测鸡AFABP基因在上述组织中的表达规律，结果发现AFABP基因仅在鸡脂肪组织中表达。李文娟等［20］以矮脚鸡、白来航鸡和北京油鸡3种公、母不同和日龄各异的脂肪为材料，采用荧光定量PCR，检测AFABP基因在所测组织中的相对表达量。结果发现不同的性别、不一样的品种、不同的日龄对AFABP基因的表达量有显著差异。张红等［21］采用实时定量Real－Time PCR 法对鸭A－FABP基因在所采取的组织中的表达规律进行差异分析。证实该基因在脂肪组织中表达量最高，在心脏、肌胃、肝等组织中均有少许表达，而在其它组织中几乎不表达。2009年，杨志刚等［22］对朗徳鹅的A－FABP基因的表达规律采用Real－Time PCR 方法检测。研究表明，该基因在肝脏中的表达量最高，脂肪仅次于肝脏，脑组织中的表达量是所有组织中最少的一个组织。这些研究均证明A－FABP基因与脂肪的代谢有着密不可分的关系，但在不同的物种中该基因的表达量不同。本研究结果显示A－FABP基因在荷斯坦牛脂肪组织中的表达量远远高于其他组织。

SREBP－1的作用主要包括调控脂肪细胞的分化，以及类固醇和脂肪酸的合成过程。SREBP－1基因可以直接调节脂肪沉积，还可参与脂肪生成相关基因的表达水平的调控，间接调节脂肪的生成。目前对SREBP－1基因的研究也主要集中在猪、鸡、兔上。例如，2001年，Gondret等使用Northern印迹法对SREBPmRNA 猪、鸡、兔的组织中的表达量在进行检测分析，预测SREBP－1和SREBP－2这两个基因在肝脏和脂肪这两种组织间的相对表达量的高低［23］。SREBP－1 mRNA 在兔的肝脏以及脂肪组织中从表达水平上看几乎保持在一个水平，在鸡的脂肪组织中SREBP－1 mRNA 的表达水平比在肝脏中低了近乎3 倍左右［24］。除此之外，SREBP信号转导途径在脂肪代谢性疾病研究中起着重要的作用［25］。本研究检测SREBP－1基因在牛的组织中的相对表达量，发现SREBP1基因在荷斯坦牛的所有组织中均有表达，但在脂肪组织中表达量最高。

秦川牛和雪龙黑牛的选育代表了我国肉牛育种中两种主流方法，秦川牛采用本品种选育，保持了其耐粗饲、抗逆性强、肉质风味独特等优良特性，雪龙黑牛是采用杂交育种方式获得优质肉牛杂交组合，其生长速度以及脂肪沉积能力显著高于秦川牛。本试验旨在通过这比较A－FABP和SREBP1基因在秦川牛和雪龙黑牛中的表达差异，从而为确定影响牛肉质性状的候选基因奠定良好地基础。本研究通过实验发现A－FABP基因在雪龙黑牛肌肉和肝脏组织中的表达量显著高于秦川牛的肌肉和肝脏，而在脂肪组织中，秦川牛和雪龙黑牛表达量无显著差异。SREBP1基因在雪龙黑牛肌肉和肝脏组织中的表达量显著高于秦川牛的肌肉和肝脏，而在脂肪组织中，秦川牛表达量显著高于雪龙黑牛表达量。研究结果均显示A－FABP和SREBP1在脂肪中表达量最高，推测其在牛脂肪组织的脂质代谢过程中发挥重要作用，对脂肪的沉积起到一定的调控作用，值得深入研究。

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