Spinigerin α抗菌肽中试化发酵条件的研究

陈晓平，房丹丹

（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118）

Spinigerin α抗菌肽中试化发酵条件的研究

陈晓平，房丹丹

（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118）

在已获得Spinigerin α抗菌肽摇瓶发酵条件的基础上，对其在50 L发酵罐中的初始甘油质量浓度、补料方式、甲醇与山梨 醇混合比例、诱导温度、诱导pH值和诱导时间进行优化，并对诱导阶段甲醇与山梨醇混合体积比、诱导温度和诱导pH值进行正交试验。结果表明：甘油初始质量浓度10 g/L、补料方式为变速补料、甲醇与山梨醇混合体积比1∶1、诱导时间96 h、诱导温度24℃、诱导pH 5.0。在此最佳发酵条件下，50 L发酵罐的Spinigerin α抗菌肽产量较摇瓶条件提高20%。

spinigerin α抗菌肽；中试化；发酵条件

抗菌肽是由生物细胞特定基因编码，经诱导产生的一类具有抗菌活性的小分子多肽，大小一般在2～7 kD左右，氨基酸组成小于100个，具有广谱杀菌、强碱性、水溶性和热稳定性好等特点[1]。目前抗菌肽的制备主要是通过提取法、化学合成法及基因工程法，然而根据其各种特点来说，基因工程表达是大量获得抗菌肽的有效途径。

S p i n i g e r i n抗菌肽是一种来源于白蚁（Pseudacanthotermes spiniger）的线性抗菌肽[1]，包括25个氨基酸。该抗菌肽中的一个含有18个氨基酸的α-螺旋结构（Lys4至Leu21）保留了抗菌活性，本研究室将其命名为Spinigerin α，并已成功构建成外分泌型重组表达载体pPICZaA-Spinigerin α，将其转入GS115酵母菌体内获得重组菌GS115-S α。经诱导表达，证实其上清液对大多革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）以及部分革兰氏阴性菌（大肠杆菌、志贺氏菌）具有明显的抑菌活性。

由于抗菌肽具有广泛的应用价值[2]，已受到国内外研究者的高度重视，而关于抗菌肽的研究也只局限于基因的克隆与表达，对于后期大批量生产还没有相关报道。毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达外源蛋白的表达系统，具有遗传稳定、表达水平高、蛋白可翻译后加工、产物可分泌、可高密度发酵等许多优点[3-5]，且毕赤酵母不会因发酵产物的累积影响正常生长代谢，也易于从摇瓶培养扩大到大批量高密度发酵，因此具有用于高密度发酵的巨大潜力。

中试工艺是连接研发和生产的重要平台，是科技成果向生产力转化的重要环节[6]。本研究在前期实验获得摇瓶发酵最佳条件的基础上，通过对Spinigerin α抗菌肽50 L发酵罐中试化发酵条件的研究[7-9]，旨在获得Spinigerin α抗菌肽中试化最佳生产条件，为其工业化生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株

重组Spinigerin α抗菌肽菌株由吉林农业大学食品生物化学实验室提供；金黄色葡萄球菌 本实验室保藏菌种。

1.2 试剂

氨苄青霉素（ampicillin，Amp） 鼎国生物技术发展中心；蛋白胨、酵母提取物、琼脂 长春科隆公司；山梨醇、无氨基酵母氮源（yeast nitrogen base，YNB）培养基、Zeocin 美国Invitrogen公司；甘油、甲醇等其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.3 仪器与设备

－80℃超低温冰箱 美国Thermo Forma公司；恒温摇床 哈尔滨东明医疗器械厂；PYX-DHS恒温培养箱上海跃华医疗器械厂；AUY220电子天平 日本岛津制作所；T6紫外-可见光分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；SDJ-5L-50L/C 50 L发酵罐 上海联环生物工程设备有限公司。

1.4 培养基

酵母蛋白胨葡萄糖培养基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）：酵母提取物1 g/100 mL、蛋白胨2 g/100 mL、葡萄糖2 g/100 mL（固体培养基加入2 g/100 mL琼脂）。

1/4基础盐培养基（basic salt medium，BSM）：85% H3PO46.67 mL/L、CaSO4·2H2O 0.23 g/L、K2SO44.55 g/L、MgSO4·7H2O 3.72 g/L、KOH 1.03 g/L、甘油10 g/L，121℃、30 min高压灭菌。

甘油补料培养基：体积分数50%甘油、PTM1 4.35 mL/L。甲醇诱导培养基：体积分数50%甲醇、PTM1 12 mL/L。山梨醇补料培养基：体积分数5 0%山梨醇、PTM1 12 mL/L。

P T M 1微量元素：C u S O4·5 H2O 6.0 g/L、MgSO4·H2O 3.0 g/L、H3BO30.02 g/L、ZnCl220.0 g/L、生物素0.20 g/L、NaI 0.08 g/L、Na2MoO40.2 g/L、CoCl20.5 g/L、FeSO4·2H2O 65 g/L、H2SO45.0 mL/L，0.22 μm滤膜过滤除菌4℃备用。

1.5 方法

1.5.1 种子培养

一级种子培养：取－80℃冻存的菌种，划YPD平板（每100 mL含100 μL Zeocin），28℃培养2 d直至长出单菌落，挑取单菌落至50 mL液体YPD培养基中，28℃、300 r/min振荡培养18 h，得一级种子。

二级种子培养：将一级种子按体积分数10%接种量接种到含有2 L YPD培养基的5 L种子罐中，28℃、300 r/min振荡培养24 h，得二级种子。

1.5.2 发酵罐培养

二级种子液培养至OD600nm在2～6时，按照8%接种量接种到含有20 L BSM培养基的50 L发酵罐中进行发酵，通入无菌空气（15 L/min）调节溶氧20%以上，转速650 r/min，诱导前温度控制在28℃，通过补加25%氨水控制pH值为6.0；初始培养基中甘油耗尽时，溶氧会突然上升至80%左右，此时开始补加甘油进入细胞增殖阶段；细胞增殖20 h后进入诱导阶段，每12 h补加甲醇进行诱导，保持发酵液中甲醇终体积分数为1%左右；整个发酵持续120 h，发酵结束后4℃、12 000 r/min离心10 min收集上清液备用。

1.5.3 菌液浓度测定

发酵开始后每12 h取发酵液，测定OD600nm值，以相同体积的培养基做空白对照。

1.5.4 表达产物抑菌活性检测

将处于对数生长期的金黄色葡萄球菌悬浮液100 øL，均匀涂于LB固体培养基平板上，用灭菌打孔器（直径3 mm）打孔，滴加50 øL待测的发酵液上清，以同体积pPICZα A空载体转化酵母表达蛋白为阴性对照，以50 øL Amp（100 øg/mL）为阳性对照。37℃培养过夜后测量抑菌直径。

1.5.5 总蛋白质含量测定

用Bradford 蛋白定量试剂盒分别测定发酵罐上清液中的总蛋白质含量、摇瓶条件表达上清液总蛋白质含量、pPICZα A空载体转化酵母表达上清液总蛋白质含量。

1.5.6 发酵条件优化的单因素试验

1.5.6.1 初始发酵培养基中甘油质量浓度

将BSM基础盐培养基中的初始甘油质量浓度分别设为5、10、20、35、55 g/L，其他条件按照1.5.2节，培养20 h测定菌体浓度，重复7次取平均值。

1.5.6.2 甘油补料方式

分批补料发酵培养开始后，溶氧突然上升说明初始发酵培养基中甘油耗尽，一次加入终质量浓度为40 g/L甘油培养4 h和变速补加甘油培养4 h，第1小时补加5 g/L、第2小时增加到10 g/L、第3小时继续补加10 g/L、第4小时减少到8 g/L，其他条件按照1.5.2节，补加结束后取发酵液测菌体浓度，重复7次取平均值。

1.5.6.3 甲醇补料方式

甘油补料结束后，饥饿0.5 h，进入甲醇诱导阶段，分别以下列3种方式添加甲醇进行诱导。方法1：每12 h补加一次甲醇使其终体积分数为1.0%；方法2：先补加发酵液总体积0.5%的甲醇，当该体积分数甲醇消耗完后开始每小时补加6 g/L甲醇，20 h后将补加量提高到20 g/L，并维持至发酵结束；方法3：诱导初期开始每小时添加6 g/L甲醇，20 h后将补加量提高到20 g/L，并维持至发酵结束。通过调节转速和通气量使溶氧量在20%以上，保证发酵结束后诱导所用甲醇体积分数相同，其他条件按照1.5.2节，收集上清液做抑菌实验，重复7次取平均值。

1.5.6.4 甲醇与山梨醇混合体积比

诱导阶段采用混合碳源进行诱导表达，甲醇与山梨醇体积比分别设为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，进行诱导表达，其他条件按照1.5.2节，发酵结束后收集上清液做抑菌实验，重复7次取平均值。

1.5.6.5 诱导时间

诱导过程中，分别在24、48、72、96、120 h收集上清做抑菌实验，重复7次取平均值。

1.5.6.6 诱导温度

甘油补料结束后，饥饿0.5 h，进入甲醇诱导阶段之前，将温度分别设定为22、24、26、28、30 ℃，然后进行甲醇诱导表达，其他条件按照1.5.2节，发酵结束后收集上清液做抑菌实验，重复7次取平均值。

1.5.6.7 诱导pH值

甘油补料结束后，饥饿0.5 h，进入甲醇诱导阶段之前，将pH值分别设定为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，然后进行甲醇诱导表达，其他条件按照1.5.2节，发酵结束后收集上清液做抑菌实验，重复7次取平均值。

1.5.7 正交试验筛选最佳发酵条件

将单因素优化的甲醇与山梨醇混合体积比例、诱导温度、诱导pH值进行三因素三水平正交试验，以期获得最佳诱导条件组合。

2 结果与分析

2.1 最佳发酵条件的单因素试验

2.1.1 初始发酵培养基中甘油质量浓度对发酵初期菌体密度的影响

图1 初始发酵培养基中甘油质量浓度对发酵初期菌体密度的影响Fig.1 Effect of initial glycerol concentration in the fermentation medium on cell density

初始发酵培养基中甘油浓度对发酵初期菌体密度影响如图1所示。初始培养基中甘油质量浓度10 g/L时，甘油会很快耗尽，补料时间提前，对补料前的生长阶段非常有利。所以如果能够在后期甘油补料过程中控制适当的甘油质量浓度，可使培养基中的菌体一直保持较好的状态，从而有效地缩短发酵时间，提高菌体密度。

2.1.2 不同甘油补料方式对发酵初期菌体密度的影响

图2 不同甘油补料方式对发酵初期菌体密度影响Fig.2 Effect of glycerol-feeding methods on cell density

不同甘油补料方式对发酵初期菌体密度的影响如图2所示。一次性补加甘油时菌体密度增长不如变速式补加甘油增长的快，原因可能是瞬间甘油过量改变了培养基中各组分的比例，使酵母生长环境改变较大，对菌体生长产生一定限制。而变速式补加甘油使发酵液中甘油质量浓度一直维持在菌体最适生长浓度从而有利于菌体快速增长，在对数期达到较高的菌体密度，为后期诱导产生更多的目的产物提供基础。

2.1.3 甲醇补料方式对发酵后期产物的影响

图3 甲醇补料方式对发酵后期产物影响Fig.3 Effect of methanol-feeding methods on the antibacterial activity of fermentation end-products

甲醇补料方式对发酵后期产物影响结果如图3所示。方法2抗菌肽的表达量最高，甲醇是在毕赤酵母产抗菌肽的过程中既是碳源又是诱导物，甲醇的体积分数及其补加方式对抗菌肽的表达影响很大，甲醇体积分数过高会对细胞产生毒害作用，而甲醇体积分数过低则不能有效诱导醇氧化酶启动子AOX的转录。而方法2使甲醇一直维持在诱导最适浓度，这样对对外源蛋白高效表达非常有利。所以甲醇最终补加方式选择方法2。

2.1.4 甲醇与山梨醇混合比例对发酵后期产物的影响

甲醇与山梨醇混合比例对发酵后期产物影响研究结果如图4所示。甲醇与山梨醇混合体积比为1∶1时，抑菌效果要高于其他混合比例，因此确定最佳甲醇与山梨醇混合体积比为1∶1。

图4 甲醇与山梨醇混合体积比对发酵后期产物影响Fig.4 Effect of methanol/sorbitol ratio on the antibacterial activity of fermentation end-products

2.1.5 诱导时间对发酵后期产物影响

图5 诱导时间对发酵后期产物影响Fig.5 Effect of induction duration on the antibacterial activity of fermentation end-products

诱导时间对发酵后期产物影响研究结果如图5所示。诱导96 h抗菌肽表达量最高，之后随诱导时间的增长抗菌肽表达量有所下降，可能是由于代谢产物积累，导致抗菌肽降解所致。因此确定抗菌肽的最佳诱导时间为96 h。

2.1.6 诱导温度对发酵后期产物影响

图6 诱导温度对发酵后期产物影响Fig.6 Effect of induction temperature on the antibacterial activity of fermentation end-products

诱导温度对发酵后期产物影响研究结果如图6所示。诱导阶段的温度过高会使菌体过早衰老，发酵周期缩短，降低蛋白表达量和活性，28 ℃比30 ℃抗菌肽的表达量高，因此确定最佳诱导温度为28 ℃。

2.1.7 诱导pH值对发酵后期产物影响

诱导pH值对发酵后期产物影响研究结果如图7所示。pH值对菌体生长和诱导表达都会产生影响，尤其是诱导时的pH值，不仅会影响蛋白表达量和活性，而且会通过影响蛋白酶活性，来改变蛋白的降解程度，选择诱导pH值为5.5，此时抗菌肽表达量最高。

图7 诱导pH值对发酵后期产物影响Fig.7 Effect of induction pH on the antibacterial activity of fermentation end-products

2.2 最佳发酵条件的正交试验正交试验优化方案及结果如表1所示。从极差R可以看出，3个因素的影响大小依次为：A＞C＞B，最优组合为：A1B3C3，即甲醇与山梨醇体积比为1∶1、诱导pH 5.0、诱导温度24 ℃，此条件下诱导产生的抗菌肽表达量最高。

表1 抗菌肽中试化发酵条件正交试验（L9（33）设计方案及结果Table 1 Orthogonal array design L9 (33) and resullttss

2.3 表达产物抑菌活性

图8 Spinigerin 对金黄色葡萄球菌的抑制作用Fig.8 Inhibitory effect of Spinigerin α on Staphylococcus aureus

发酵罐表达上清液与摇瓶发酵表达上清液对金黄色葡萄球菌抑菌作用结果如图8所示。毕赤酵母可以从摇瓶水平扩大到发酵罐培养，且通过本实验对发酵罐中几个影响发酵的因素进行优化使其产量较摇瓶水平有所提高，阳性对照显示Spinigerin α抗菌肽抑菌活性较同体积Amp强，阴性对照无抑菌活性，因此排除了除Spinigerin α抗菌肽其他成分的抑菌作用，说明后期应用毕赤酵母表达抗菌肽只要将影响发酵条件的因素全部找到并且进行优化，相信毕赤酵母表达抗菌肽可以实现工业化生产。

2.4 蛋白质含量测定结果

通过发酵罐最终获得Spinigerin α抗菌肽19.2 mg/L，摇瓶条件下Spinigerin α抗菌肽为16 mg/L，发酵罐比摇瓶条件下表达量提高了20%，抑菌活性也明显提高。

3 讨 论

溶氧是酵母生长过程中最重要的营养成分之一，可直接影响酵母的生长和代谢[10-13]，同时溶氧在一定程度上也反映了培养基中碳源的消耗情况，为及时补加碳源提供依据，溶氧逐渐下降说明菌体生长消耗了氧气，溶氧突然上升表明菌体营养缺乏，需要补加营养物质，但溶氧过低过高都不适合酵母生长。本实验根据文献选择了溶氧控制在20%的培养条件，酵母生长正常。

Spinigerin α抗菌肽发酵过程概括起来包括两大部分，一是菌体的增殖阶段，二是诱导表达阶段，而后者直接影响了目的产物的产量，周祥山[14]、Chauhan[15]、Zhu Taicheng[16]等采用在低温条件下，山梨醇与甲醇混合诱导，实现了β-甘露聚糖酶迄今为止最高产量6 336 U/mL。汪志浩[17]、Soyaslan[18]等通过优化pH值证明，在pH值大于5.0时山梨醇消耗速率下降，而当pH值为4.5时红细胞生成素最高产量为0.16 g/L。因此本实验在前期实验基础上，对诱导阶段甲醇与山梨醇混合体积比、诱导温度和诱导pH值三者的综合影响进行正交优化试验研究。结合菌体增殖阶段优化得到的最优条件，实现了Spinigerin α抗菌肽50 L规模化生产。一般而言，提高发酵规模，发酵能力会有所下降，而本实验却有所提高，考虑可能与发酵罐中可以准确的控制溶氧﹑控制细胞增殖与诱导阶段补料量和整个发酵过程中采用变温与变pH值发酵有关。

近几年研究发现在毕赤酵母表达体系中，山梨醇和甲醇的混合补料不但可以增加细胞密度缩短诱导时间，最重要的是可以提高外源蛋白的表达量。由于甘油混合诱导会抑制启动子AOX1的活性，不利外源蛋白的表达，而山梨醇则不会因为其积累而抑制AOX1的活力[19-20]，因此本实验直接选用山梨醇与甲醇混合补料进行研究。

Spinigerin α抗菌肽中试化生产的最佳发酵条件为：8%接种量接入装有20 L BSM基础盐培养基的50 L发酵罐中，溶氧20%，转速650 r/min，诱导前温度为28 ℃、pH值为6.0进行发酵培养；初始培养基中甘油耗尽后，溶氧急剧上升至80%左右，开始补加甘油，第1小时补加5 g/L，第2小时增加到10 g/L，第3小时继续补加10 g/L，第4小时减少到8 g/L；待甘油耗尽溶氧再次上升至80%左右，此时饥饿0.5 h以将发酵液中残存的阻遏性碳源物质（甘油和乙醇）消耗尽，进入甲醇与山梨醇混合诱导阶段；控制诱导温度为24 ℃，pH值为5.0，先向培养基中加入终体积分数为0.5%的甲醇，待初始甲醇耗尽，开始每小时补加甲醇与山梨醇（体积比1∶1）6 g/L维持此速度诱导4 h，使菌体适应甲醇诱导，之后速度增加到20 g/L，整个发酵过程持续96 h。在此最佳发酵条件下，Spinigerin α抗菌肽的50 L发酵罐产量较摇瓶条件下提高20%。

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Optimization of Pilot-Scale Fermentation Conditions for the Production of Spinigerin α as an Antibacterial Peptide

CHEN Xiao-ping, FANG Dan-dan
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

In this study, various fermentation conditions for the production of the antibacterial peptide Spinigerin α in a 50-L fermentor, including initial glycerol concentration, feeding methods, methanol/sorbitol ratio, induction temperature, pH and time were optimized based on the previously established shake flask fermentation conditions. An orthogonal array design involving methanol/sorbitol ratio (V/V), induction temperature and pH was used. Results showed that the optimal pilot-scale fermentation conditions were 10 g/L initial glycerol concentration, feeding at variable speeds, 1:1 methanol/sorbitol ratio (V/V) and induction at 24 ℃ and pH 5.0 for 96 h. The yield of Spinigerin α in a 50 L fermentor under the optimized conditions was increased by 20% than under shake flask fermentation conditions.

the antibacterial peptide Spinigerin α; pilot scale; fermentation conditions

TQ92

A

1002-6630（2014）07-0138-05

10.7506/spkx1002-6630-201407028

2013-03-31

吉林省科技厅科技发展计划项目（20060208）

陈晓平（1963—），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术与功能食品。E-mail：837340652@qq.com