狐狸支气管败血波氏杆菌的分离与鉴定

秦绪伟

狐狸支气管败血波氏杆菌的分离与鉴定

秦绪伟

（齐鲁动物保健品有限公司 山东 济南 250100）

本试验是从山东菏泽某狐狸养殖场发病狐狸分离到一株细菌，经生化试验、PCR、16sRNA测序最终确定为支气管波氏杆菌，经动物试验确定为致病性波氏杆菌，经药敏试验选择阿奇霉素作为理想的药物，最终取得良好的治疗效果。

狐狸 支气管波氏杆菌 分离 药敏试验 鉴定

支气管败血波氏杆菌属于波氏杆菌属，普遍存在于多种动物，常会引起兔子的波氏杆菌性鼻炎、猪的萎缩性鼻炎[1]，特别是兔子感染率、死亡率都较高[2]，给养殖场带来极大的损失。兔子、猪、犬波氏杆菌病有人报道，但是狐狸的波氏杆菌少见报道，毛皮动物养殖业这几年发展迅速，许多动物的下脚料都成为了毛皮动物的肉类食物，盲目扩群但环境卫生管理不善，引起各种疾病发生，本实验从山东菏泽一狐狸养殖场发病狐狸分离到一株细菌，经一系列生化试验、PCR、基因测序、毒力试验确定为支气管败血波氏杆菌，经药敏试验，采取加强管理、药物注射方式取得了良好的效果，控制了疫情。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 山东菏泽一800只狐狸养殖场。发病狐狸精神沉郁，食欲减退，咳嗽、甩鼻、流涕，发病狐狸经解剖无菌条件分离肺脏、气管，获得一株细菌。

1.1.2 其他材料 营养琼脂、SS琼脂、麦康凯琼脂培养基等购自青岛海博生物技术有限公司；微量生化试剂管购自北京路桥技术有限责任公司；药敏纸片购自杭州天和微生物试剂公司；PCR试剂购自大连宝生物工程有限公司；实验室其他常规试剂。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养 对发病狐狸解剖，无菌条件下取肺和气管环内容物，接种于血清营养琼脂，在37℃恒温培养箱培养48h，培养出的细菌挑取单个菌落进行纯化，同时接种麦康凯琼脂培养基，观察菌落形态。

1.2.2 细菌的生化试验 血清平板挑取单个菌落，接种于马丁肉汤培养基培养，在37℃恒温培养箱培养48h，分别取0.2ml接种于乳糖、葡萄糖、水杨苷、甘露醇、木糖、蔗糖、肌醇、山梨醇等微量生化反应试管，24h后观察生化反应结果。

1.2.3 细菌的分子生物学鉴定 （1）16S rRNA：无菌挑取平板上的菌落加入到1ml无菌水中，震荡混匀后沸水浴7min，冰浴5min，离心上清作为基因扩增的模板，设计引物：F1-5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，R1-5’ACG GCT ACC TTG TTG TTA CGA CTT-3’，PCR反应体系(50ml)：10*PCR Buffer(含MgCl215mmol/L，KCl500 mmol/L)5ml，2.5mmol/L dNTP 4ml，引物(20umol/L)各1ml，模板2ml，ddH2O36.8ul，Taq酶(5U/ml)0.25ml。PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 1.5min，30个循环；72℃ 10min。取PCR产物5ml用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物送交上海基因测序公司进行测序，将测序结果提交Genbank进行比对，构建系统发育树，判定细菌的系统发育地位，以97%相似性为界限判定为何种菌。（2）种特异性PCR。根据支气管败血波氏杆菌鞭毛蛋白基因设计引物Fla1：TGG CGC CTG CCC TAT，Fla2：AGG CTC CA AGA GAG AAA GGC TT进行PCR扩增。细菌DNA提取用热裂解法。PCR反应体系(50ml)：10*PCR Buffer(含MgCl215mmol/L，KCl500mmol /L)5ml，2.5mmol/L dNTP 4ml，引物(20umol/L)各1ml，模板2ml，ddH2O36.8ml，Taq酶(5U/ml)0.25ml。PCR反应条件：94℃ 3min；94℃ 1min，56℃ 45s，72℃ 1.5min，35个循环；72℃ 10min。取PCR产物5ml用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，观察扩增出的片段大小。

1.2.4 细菌的药敏试验 使用药敏纸片法对分离的细菌进行药敏试验，培养过夜后量取抑菌圈的直径，判定该菌的耐药性。。

1.2.5 细菌的毒力试验 在营养琼脂平板无菌取单个菌落，接种于马丁肉汤培养基，37℃恒温摇床培养箱培养48h，分别取培养液原液和100倍稀释液注射18g~22g小白鼠各3只，0.3ml/只，腹腔注射，注射后观察7d，对照组3只，若有死亡对死亡的小白鼠解剖再进行细菌分离。

2 结果

2.1 细菌培养结果

无菌分离病狐狸的气管、肺，血清平板上37℃温箱48h培养可见圆形、稍微隆起、奶油样灰白色菌落，转接后在麦康凯上37℃温箱48h培养可见圆形蓝灰色、光滑、隆起的菌落，周围有狭窄的红色环；马丁肉汤震荡培养24h可见液体混浊，图片镜检可见革兰氏染色阴性，杆状或者球杆状，形态较小，有荚膜无芽孢。

2.2 细菌的生化结果

将分离菌进行了微量生化试验，试验结果表明该菌对乳糖、葡萄糖、水杨苷、甘露醇、木糖、蔗糖、肌醇、山梨醇、阿拉伯糖等糖醇类都为阴性，氧化酶、脲酶、利用柠檬酸、还原硝酸盐、运动性都为阳性。具体结果见表1。

表1 分离菌生化鉴定结果

注：“—”表示阴性，“+”表示阳性

2.3 细菌的分子生物学鉴定结果

2.3.1 16S rRNA结果 根据上海测序公司的测序结果，采用Bioedit软件参照正反向序列图谱对序列进行人工校对，然后输入Genbank用Blastn软件进行相似性比较，最后利用构建系统发育树，与支气管波氏杆菌相似性为99.9%，最终确定为支气管波氏杆菌。

2.3.2 种特异性PCR结果 电泳后扩增出了237bp左右的片段，符合支气管波氏杆菌的相应大小的片段。

2.4 细菌的药敏试验结果

将波氏杆菌涂布于血清营养琼脂平板，把标记好的药敏片贴于血清平板，最终根据抑菌圈的大小判定药物的敏感程度，其中阿奇霉素、头孢噻呋、左氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星高度敏感；壮观霉素、庆大霉素、链霉素、复方新诺明、林可霉素、万古霉素、磷霉素不敏感。最终选择阿奇霉素作为治疗药物。具体药敏结果见表2。

表2 分离菌的药敏结果 （mm）

2.5 毒力试验结果

无菌挑取单个菌落接种于马丁肉汤培养基，37℃恒温培养24h后进行细菌计数，计数为25亿/ml，将细菌原液和100倍稀释液分别注射小白鼠3只，注射原液组第3日全部死亡，100倍稀释液注射后7d无死亡，即7.5亿细菌对小白鼠有致死性毒力，750万细菌对小白鼠没有毒力，分离菌属于中等毒力。

3 讨论

3.1 狐狸波氏杆菌的分离

波氏杆菌初次分离生长缓慢，此次细菌分离培养18h未见明显的菌落，在培养36~48h可见针尖大小的透明的菌落。在分离细菌时不能过夜后没有见到细菌就放弃分离，那样会错过分离到波氏杆菌的机会。此次细菌分离经解剖、生化试验、PCR等方法最终诊断为支气管败血波氏杆菌，毒力属于中等毒力。

3.2 狐狸波氏杆菌的诊疗

此次病例养殖场狐狸以咳嗽、甩鼻、流涕为主要特征，发病较快、发病率高、死亡率较低，解剖后可见肺部出血、气管环内大量脓性粘液，通过一系列的细菌分离、生化试验、PCR、基因测序等实验室诊断最终确诊为支气管败血波氏杆菌，根据药敏试验选择了阿奇霉素作为治疗的首选药物，通过连续3d的治疗取得了良好的效果，咳嗽、甩鼻的狐狸明显减少，最终控制了疫情。狐狸的波氏杆菌报道的很少，一般不作为致病主因，在临床上也不容易确诊，发现咳嗽、甩鼻、流涕为主要特征时一般按照普通的感冒治疗，有时候效果不理想，咳嗽增多、食欲下降、生长缓慢，在临床上发现多例类似病例，特别是秋冬交替的季节发病较多，按照药敏试验选择敏感的药物，另外配合止咳、平喘、化痰的药敏治疗效果比较明显，按照疗程治疗一般死亡率都较低。

3.3 狐狸波氏杆菌的预防

波氏杆菌主要侵害呼吸道，特别是应激的条件下多发，季节交替、天气变化、阴雨连绵、转群等条件下经常可以见到，表现为咳嗽、流涕，在实际的生产中我们要降低各种应激，在可以预见的应激来临之前可以使用电解多维、葡萄糖、VC等药物来降低应激，另外要保持环境卫生、清理粪便、定期消毒，控制病原菌的传播。兔子有波氏杆菌的疫苗，但还是时有发生，狐狸没有波氏杆菌的疫苗预防，还要从环境等因素进行预防，防止疾病的发生。

[1] 陆承平. 兽医微生物学第5版[M]. 北京: 中国农业出版社, 2013, 155-157.

[2] 谢三星. 兽医全攻略兔病[M]. 北京: 中国农业出版社, 2009, 128-132.

（2014–01–21）

S858.92

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1007-1733(2014)05-0008-02