生物发酵法处理病死猪后肺炎克雷伯菌效果的监测

王苗利 田夫林 陈 静 王贵升 孙圣福 李玉杰 徐 鸿 尹斐斐 刘丽平 王世荣

生物发酵法处理病死猪后肺炎克雷伯菌效果的监测

王苗利 田夫林*陈 静 王贵升 孙圣福 李玉杰 徐 鸿 尹斐斐 刘丽平 王世荣

（山东省动物疫病预防与控制中心 山东 济南 250022）

本试验利用细菌分离、培养、生化鉴定方法对临沂沂水县某猪场的病死猪生物发酵无害化处理堆的肺炎克雷伯菌进行了追踪监测，结果表明，在21d的追踪监测后，2组试验中的肺炎克雷伯菌均已在7d后被杀灭，之后直至第21d均未再检测到肺炎克雷伯菌。表明临沂沂水县某猪场采取的生物发酵法无害化处理病死猪对肺炎克雷伯菌的杀灭效果显著。

细菌分离 生化鉴定 无害化处理 肺炎克雷伯菌

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是肠杆菌科常见的条件致病菌, 革兰阴性,大小为0.3~1.5μm×0.6-6μm，单个成双或短链排列，痰标本直接涂片，菌体呈卵圆形或球杆菌，单个或成双排列．荚膜染色外周可见透明、环状荚膜。随着第三代头孢菌素等广谱抗菌药的广泛使用，产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)菌株不断增多，成为临床治疗的难题之一[2]。因此，如何消灭病死猪携带的肺炎克雷伯菌，消灭传染源，成为养殖场持续发展面临的难题。

病死畜禽的无害化处理是消灭传染源最有效和最彻底的措施，特别是当前正值重大动物疫病防控的重要阶段和食用农产品质量安全水平全面提升的关键时期[3]。目前，养殖场对病死畜禽的处置方式主要有两种，一是焚烧，无论用电或油均需要专门的设施设备，购置设备费用高，处理成本大，而且焚烧气味大、有害成分多；二是深埋，多数养殖场(户)对病死动物采用掩埋法，但掩埋的地点、深度和方法不符合有关规定。在夏季，被掩埋的动物尸体出现被雨水浸泡后溢出，还存在食肉动物扒出、被人偷掘挖出加工变卖等严重隐患，同时，多数掩埋地点不符合要求，容易污染周边地下水源。因此，寻求有效、方便、环保的病死畜禽的无害化处理技术方法显得尤为必要。

生物发酵床养猪技术起源于日本民间，在日本、韩国被大力推广和广泛应用，是近年我国引进的一项新兴养猪技术，又称“自然养猪法”、“零排放养猪法”或“生物环保养法”[4]。生物发酵床养猪技术是根据微生态理论，利用自然界的微生物资源，即自然界中多种有益微生物，通过选择、培养、检验、扩繁，形成有相当活力的微生物母种，再按一定比例将其与锯末、谷壳等辅助材料、活性剂等混合和发酵制成猪圈有机垫料。猪排泄出来的粪、尿被垫料掩埋，水分被发酵过程中产生的热蒸发，使猪粪、尿中的有机物质得到充分的分解和转化，达到无臭、无味、无害化的目的，是一种无污染、无排放、无臭气的环保养猪技术[5]。但是目前尚无有关生物发酵法无害化处理病死动物对微生物杀灭效果的有关试验及数据，因此，对生物发酵法无害化处理病死畜禽技术进行杀灭各类细菌的效果追踪监测及评估势在必行。

1 材料与方法

1.1 材料

法国科玛嘉显色定位培养基(批号LOT646)、麦康凯选择培养基(批号1303271)、TSA培养基(批号20120829，青岛高科园海博生物技术有限公司)、法国生物梅里埃ID32E生化反应条(批号1002551050)

1.2 方法

1.2.1 样品采集 本次实验共对两组堆体的样品进行采集，分别为A组、B组，结合生产操作，于埋入病死猪前脏器病原菌分离、以及于0d、7d、14d、21d分别取样。取样位置按照堆体对角线至少布置3个点，每个采样点分表层3~5cm、中心20~30cm、深部40~50cm进行取样，每个样品200g左右，塑料袋密封。试验中，2组各采集12份样品，每层采集4份。

在病死猪埋入前样品的采集，遵循操作安全、无菌，采样由小到大、病变与健康组织兼顾的原则。脾、肾、淋巴结可以采取完整的一个。肝、肺等可以采集病变和健康组织交界处，至少5×5cm大小。肠或气管，采集带病变部位至少5cm长。

1.2.2 细菌分离、鉴定 将2组病死猪的脏器样品以及发酵堆每周采集的样品按照细菌学无菌操作接种于麦康凯培养基和科玛嘉显色定位培养基上，将平板倒置放于37℃的温箱培养18~24h，后拿出观察菌落形态。肺炎克雷伯菌在麦康凯形成隆起、大而粘液样融合一起的粉红菌落，用接种环挑起呈丝状粘连；在科玛嘉显色定位培养基上生长为蓝色圆形菌落。挑取可疑菌落进行革兰氏染色、镜检，若为革兰阴性杆菌，单个成双或短链排列，则初步判定为肺炎克雷伯菌。挑取可疑菌落接种在TSA固体培养基上，37℃的温箱培养18~24h，纯化出单菌落，按照无菌操作要求接种到法国生物梅里埃ID32E生化反应条上，37℃的温箱培养18~24h，进行生化试验结果的判读。

2 结果与分析

2.1 细菌生化鉴定结果

将2组病死猪的脏器样品以及发酵堆每周采集的样品接种到麦康凯选择培养基上培养18~24h后，形成隆起、大而粘液样融合一起的粉红菌落，用接种环挑起呈丝状粘连，革兰氏染色后镜检为革兰氏阴性杆菌，在科玛嘉显色定位培养基上生长为蓝色圆形菌落，疑似肺炎克雷伯菌。2组样品的可疑菌落接种到法国生物 梅里埃ID32E生化反应条上，经37℃的温箱培养18~24h后，读取结果表明，2组发酵堆均分离到了肺炎克雷伯菌。生化结果见表1(A组)、表2(B组)。

表1 A组发酵堆分离出的肺炎克雷伯生化谱

表2 B组发酵堆分离出的肺炎克雷伯生化谱

2.2 肺炎克雷伯菌杀灭效果追踪结果

通过对A组、B组不同采样时期的样品全部进行肺炎克雷伯菌检测鉴定后，发酵堆对肺炎克雷伯菌的杀灭效果明显，结果见表3。

表3 A组、B组发酵堆对肺炎克雷伯菌的杀灭效果

3 结论

由试验结果可知，2组无害化处理后，肺炎克雷伯菌均已在7d后被杀灭，之后直至第21d均未再检测到肺炎克雷伯菌。结果表明，临沂沂水县某猪场采取的生物发酵法无害化处理病死猪对肺炎克雷伯菌的杀灭效果显著。

4 讨论

被丢弃的病畜禽尸体其所带的细菌、病毒会随空气或其他途径迅速传播扩散，如果是重大动物疫病或人畜共患病，会造成重大动物疫情或人畜共患病发生，人畜生命安全就会受到威胁，经济就会受到严重损失，影响畜牧养殖业的发展[1]。

近年来，山东省省的养猪场虽然没有发生重大动物疫情，但全省猪疫病病种多、病原复杂、污染面广、隐性带毒的现象仍然存在，重大动物疫情发生的风险仍然很大，肺炎克雷伯等人畜共患病有出现局部散发乃至流行的可能，猪伪狂犬病等其他动物疫病也存在局部流行的风险。随着畜牧业生产规模不断扩大，养殖密度不断增加，猪感染病原机会增多，病原变异几率加大，新发疫病发生风险增加。因此，开展生物发酵法病死猪无害化处理是发展生态畜牧业的需求，追踪监测生物发酵无害化处理技术对病原微生物的杀灭效果，为开展病死猪无害化处理的研究提供理论依据。

生物发酵床养猪因其众多的优点受到国内外广大养殖户喜爱，但在实际应用过程中也存在一些不足的地方，例如夏季发酵舍内温度过高，若通风不好，将会导致工作人员的工作环境较为恶劣，因此，相关的工作人员要做好相应的防护。另外，如何进一步提高生物发酵无害化处理病死猪的微生物杀灭效果，并进行推广，有待于进一步研究。

[1] 邓敏, 刘莹, 曾吉等. 肺炎克雷伯菌分布特征及耐药性分析[J]. 中国抗感染化疗杂志, 2001, 1(2): 98-99.

[2] 王联芳, 朱新华. 病死畜禽无害化处理存在的问题及对策[J]. 医学动物防制, 2008, 24(11): 876-877.

[3] 杜晓光，武俊海. 发酵床养猪PK农村户用沼气[J]. 中国动物保健, 2008(5): 26-28.

[4] 武华玉, 乔木, 彭先文等. 对生物发酵床养猪技术的认识[J]. 畜牧与饲料科学, 2009, 30(6): 101-102.

[5] 方焕森. 浅谈对病死畜禽无害化处理过程中存在的问题及对策[J]. 中国畜牧兽医文摘, 2011, 27(5): 2-2.

病死畜禽无害化处理技术推广项目，猪产业体系创新团队项目

（2014–02–12）

S818.9

A

1007-1733(2014)05-0012-02