利用SSR 技术分析我国16 种甜玉米的遗传特性

黄华如 梁凯光 蚁珩鑫 梁雪莲

（仲恺农业工程学院生命科学学院，广州 510225）

随着人类人口的激增，对粮食的需求不断增加，甜玉米的营养价值逐渐被人们接受认可，甜玉米的种植在世界范围得到迅速发展。根据玉米的遗传类型和胚乳特性，甜玉米可分为3 种：普通甜玉米、超甜型甜玉米（又称水果甜玉米）和加强型甜玉米［1］。2007 年，广东省的甜玉米面积达到13.0 万hm2，产量170.82 万t，云南省种植面积约为3.5 万hm2，产量45.00 万t；广西种植面积3.2 万hm2，产量39.8万t，浙江省甜玉米发展势头也较好，种植面积达1.1万hm2，产量13.6 万t［2］。随着甜玉米产业的不断发展，甜玉米品种也不断更新换代，科研人员利用各种先进育种技术不断研发出新品种，为甜玉米的开发利用不断增加新的种质资源，提高甜玉米的产量及经济价值。

随着生物技术的发展，分子标记技术为科研人员开发利用甜玉米资源提供了强有力的技术支持。目前，主要利用RFLP、RAPD、SSR、AFLP 四种分子标记技术研究玉米的遗传多样性。研究表明，SSR分子标记是目前最适合于分析玉米种质遗传多样性及划分杂种优势群的分子标记技术［3］。

简单重复序列标记（Simple sequence repeat，SSR），又称为微卫星 DNA（Microsatellite DNA）。其操作简便、稳定可靠、重复性好，已被广泛用于遗传多样性分析、构建遗传图谱等研究领域。李新海等［4］利用SSR 标记技术用64 对扩增带型稳定的引物研究了70 份我国主要玉米自交系的遗传变异，从中检测出等位基因数目为248 个，结合多态性信息将70 份玉米划群，得出划群结果与其系谱分析和育种家经验基本相符。黄君等［5］利用SSR 标记对54 份甜玉米自交系进行了遗传多样性分析，从150 对引物中筛选出了56 对扩增条带清晰、稳定性好的引物，分析每份玉米之间的遗传特性。本试验利用SSR 分子标记技术和聚类分析法分析我国16 种甜玉米的遗传特性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 选用目前我国各地大量种植的代表性甜玉米品种，共16 份。具体材料见表1。

表1 甜玉米品种及来源

1.1.2 试剂 微卫星标记引物购自上海生物工程技术服务有限公司，EDTA、DNA Taq 聚合酶和SDS 等购自北京鼎国生物技术发展中心，其余均为国产分析纯。

1.1.3 设备 DYY-6C 型垂直板电泳仪（北京市六一仪器厂），小型高速冷冻离心机（德国eppendorf 公司），DG-3C 型水平电泳槽、DY6040 型稳压稳流电泳仪，UV-254 暗箱式紫外透射仪（北京鼎国公司），DNA 凝胶分析仪（美国GDS-800UVP），PCR 扩增仪（美国PTC-200），ALC210.4 电子分析天平（广州市正一科技有限公司），手提式不锈钢蒸汽消毒器（上海三申医疗器械有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 甜玉米基因组DNA 的提取 根据SDS 法进行DNA 提取，产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 引物筛选 微卫星标记引物购自上海生物工程技术服务有限公司，从200 对引物中筛选出10 对多态性较好的引物，引物筛选步骤如下：以金帅和皖甜1 号玉米品种的基因组DNA 为模板，更换不同的特异引物，建立以下PCR 反应体系：扩增反应体系25 μL，包括金帅DNA 模板1 μL，dNTP 0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，正向、反向引物各1 μL，Taq 酶0.5 μL，用ddH2O 调整终体积至25 μL。反应程序为：94℃预变性10 min；94℃变性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，循环30 次；72℃延伸10 min。

1.2.3 SSR 扩增产物的聚丙烯酰胺电泳检测 将20 mL 12%浓缩胶贮藏液、重蒸水20 mL、10%过硫酸铵0.4 mL，TEMED 15 μL，混合均匀后，溶液倒入两玻璃板之间，胶凝固后进行电泳，预电泳15-30 min，在10 μL 扩增产物中加入2.5 μL 10×loading buffer，混匀，电泳。电泳后将凝胶板放入10%的冰乙酸中，轻摇至凝胶指示剂无色，约30 min。换用蒸馏水洗2 次，每次1-2 min 后，然后放入0.1%染色液中，轻摇15-20 min。再用蒸馏水洗2 次，各1 min，立刻放入预冷的显影液，轻摇至DNA 条带出现，约5 min，将显影好的凝胶板用蒸馏水洗2 次，水中保存，统计结果并照相。

1.2.4 数据处理 根据 SSR 产物银染结果在相同迁移率位置上（相同的分子量片段），有带记为1，无带记为0，缺失记为9［6］。每个多态性位点的多态性含量（PIC），按Smith 等［7］的公式计算，PIC=1-∑f2

i，其中fi 为i 位点的基因频率，数据处理由统计分析软件LittlePrograme 完成。采用 Nei 等［8］的公式计算各自交系间的遗传相似系数（Genetic similarity，GS）和遗传距离（Genetic distance，GD）：GS= 2Nij/（Ni+Nj）；GD =1-GS. 其中，Nij 为第 i 个和第 j 个材料基因型间共有的条带数；Ni 和 Nj 分别为第 i 个和第 j 个材料各自的特有条带数。聚类分析按UPGMA方法对各个自交系进行聚类作图，数据统计用NTSYSpc-2.10e 软件完成。

2 结果

2.1 玉米总DNA电泳图谱

利用SDS 总基因提取法提取16 种甜玉米的总DNA，并在0.8%琼脂糖电泳中检测，得出16 种玉米DNA 条带。部分甜玉米品种的DNA 电泳（图1）显示，DNA 条带的亮度很好，但是尾部的亮点比DNA 条带亮度亮，说明所提取的DNA 里含有杂质。由于SSR 标记具有较高的灵敏性，所检测的DNA 需要微量即可，故将所提取的DNA 低温保存备用。

图1 部分甜玉米电泳图

2.2 引物筛选结果

以金帅和皖甜1 号玉米品种的基因组DNA 为模板，分别用200 对引物按1.2.3 中所述方法进行PCR，产物用0.8%琼脂糖电泳。根据琼脂糖电泳图所显示出的条带清晰度和等位基因数的多少筛选出10 对引物。图2 是部分引物筛选结果。

图2 引物筛选图谱

2.3 SSR结果分析

2.3.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 在银染后拍照，得出16 种甜玉米的指纹图谱，从图3 可以清晰的看到带谱，但片段数目较多，统计时有些困难。可能是由于退火温度没有调好，造成较多的带出现，但条带清晰，对结果不会造成较大影响。图3 为16 种甜玉米在引物6-10 中扩增的指纹图谱。

图3 16 种甜玉米指纹图谱

2.3.2 分子标记结果 表2 是16 种甜玉米在10 对引物下扩增得到的总片段数目。结果显示，16 种甜玉米扩增总片段数范围在117-174，平均为151 条，其中特大甜出现的片段数最少，只有117 条，农大超甜最多，达174 条。

10 对SSR 引物在16 份甜玉米品种中共检测出254 个等位基因位点（表3），检测出的等位基因位点变幅为5-38 个，平均每对引物检测出25.4个，引物39 检测出的等位基因位点数最少，不能把16 个甜玉米品种区分开。每个位点的多态性信息量（PIC）变化为0.681 7-0.968 7，平均为0.920 8；其中引物10-8 位点的PIC 最大为0.920 8，引物39 位点的PIC 最小为0.691 7。PIC 值的大小与于检测到的等位基因数目及基因频率有关，反映了SSR 引物是否能把某一品种与其他品种分开的能力。

表2 16 种甜玉米扩增片段总数

表3 10 对SSR 引物扩增结果

2.3.3 遗传相似性分析 利用NTSYS2.10e 版本软件，计算材料之间的遗传相似系数变化范围。经计算得出16 个玉米品种间的遗传相似系数变化范围在0.241 3-0.964 3 之间，表明品种间遗传差异相对较大，遗传多样性较高。其中金银818 和农大超甜的遗传相似系数最大为0.964 3，品种之间的相似系数大于 0.90 的共有5 对：秦龙甜、香甜1 号，皖甜1 号、华宝1 号，金银818、超甜2000 及农大超甜、超甜2000，农大超甜、金银818，说明它们之间有很高的相似性；超甜2000 和特大甜的遗传相似系数最小为0.241 3，说明这两个品种的亲缘关系比较远，遗传差异相对较大，具有较高的多样性。表4、表5显示，16 个甜玉米品种间的遗传相似系数变异较大，遗传多样性较丰富。

表4 16 个甜玉米品种间的遗传相似系数

表5 其中8 个甜玉米品种间的遗传相似系数

2.3.4 SSR 聚类分析 使用软件NTSYSpc V2.10e 对16 份玉米材料进行聚类分析，用Qualitative data 生成16 种甜玉米之间的树行图（图4）。根据聚类分析树状图，以相似系数0.753 为标准，可以将16 种甜玉米聚分为3 类群。第一类群包括金帅和特大甜，共2 个品种；第二类群有10 个玉米品种，在相似系数0.794 处又可以分为2 个亚类：秦龙甜、皖甜1号、美珍204、东方甜1 号及金黄超甜聚为一个亚类；香甜1 号、超甜2000、农大超甜、上海甜及绿色超人聚为另一个亚类，说明它们亲缘关系较近，但也有一定的遗传差异。第三类群包括华威6 号、华宝1 号、金银818 及粒粒香甜。第一类群由2 个品种聚成，说明它们与其他材料之间遗传距离比较远。第二类中的超甜2000 和农大超甜之间的相似系数最接近，变异系数较小，亲缘性较大。根据杂种优势原理，可以选用遗传关系相对较远的材料来杂交。16 种甜玉米分为3 大类，遗传距离相对较远，可以选用3 大类之间的品种进行杂交，其中第一类的金帅和特大甜与其他品种进行杂交的优势会更明显。

图4 16 种甜玉米的聚类图

3 讨论

本试验从200 对引物中筛选出10 对SSR 引物对16 种甜玉米进行遗传特性分析。经过PCR 扩增，共检测到254 个等位基因，平均25.4 个，平均PIC值为0.920 8。这一结果无论是平均等位基因数还是平均PIC 值都高于李新海等［9］的甜玉米的PIC 值（0.511）。遗传相似系数从 0.241 3 到 0.964 3，平均为0.602 8，表明16 个甜玉米品种间遗传差异相对较大，遗传多样性较高。以相似系数0.753 为标准，可以将16 种甜玉米聚为3 类群。本试验表明，SSR 分析对DNA 纯度要求不高，且带型稳定，多态性丰富，同时 SSR 标记有试验操作简单、耗时少、成本低等优点［10］。本试验的16 个甜玉米品种的遗传相似系数在 0.241 3-0.964 3 之间，平均为0.602 8，说明多数材料间具有一定的遗传差异，但总体材料遗传基础相对比较狭窄，这可能与选材范围不够广泛及核心SSR 引物的筛选有关。试验中总DNA 的提取、核心引物的筛选、SSR 技术操作的成熟度均会对试验结果有一定影响，所以寻找到一种快速有效的方法是得出正确结果的重要因素［11］。利用SSR 分子标记和聚类分析手段，可以对不同物种的遗传距离、亲缘关系等进行分析。从而确定物种之间的遗传距离，进而进行种群分类。赵瑞芳等［12］利用SSR 分子标记技术研究了12 个玉米品种间的遗传关系，聚类分析结果表明，12 个玉米品种间的聚类划群结果与玉米品种的系谱来源基本一致。

4 结论

在本次试验中将供试的16 个甜玉米品种划分为3 个类群，聚类结果与16 个甜玉米品种的种植区域基本一致。结果再次证明利用 SSR 标记进行甜玉米品种间的遗传特性分析及种群分类是可行的。

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