索骨丹总蒽醌和鞣质对细胞因子的影响

王晓梅，赵 岩，樊晓娜，刘 丹，杨春娟，刘 帆

（1.宝鸡文理学院化学化工学院，陕西 宝鸡721013；2.宝鸡市中医医院，陕西 宝鸡721001）

索骨丹，又名秤杆七、老蛇盘、鬼灯檠、老汉求等，为虎耳草科索骨丹属植物索骨丹（Rodgersia aesculifolia Batal.）的根茎，系陕西秦岭山中的民间药物。性味：涩，苦，微甘，平。功效：健脾燥湿，收敛固涩，止血，止泻，止带。用于湿阻脾胃、运化失司所致的纳呆、腹胀、腹泻、白带，外伤出血、衄血，吐血、崩漏、脱肛、子宫脱垂，风湿筋骨痹痛、咽喉肿痛等症，单用或配伍使用。由于治疗范围广，在秦岭当地应用较多［1－3］。索骨丹所含化学成分包括矮茶素、蒽醌、鞣质、黄酮、糖类等。作者就索骨丹总蒽醌和鞣质提取物对人单核细胞受脂多糖刺激后产生和释放致炎细胞因子（IL－1β、IL－6、TNF－α）的影响，探讨其对炎症性疾病和免疫反应性疾病治疗的部分机制，为秦岭民间药材的深入开发奠定基础。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

索骨丹，购自太白山，经陕西中医学院胡本祥教授鉴定。

人单核细胞白血病细胞THP－1、THP－1专用培养基（含1640、10%FBS＋b－巯基乙醇、青霉素、链霉素）；胰蛋白酶（Solon Ind.Pkwy）；Human TNF－αELISA试剂盒、Human IL－1βELISA试剂盒、Human IL－6 ELISA试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司；脂多糖（LPS），科奥生物工程有限责任公司。

Galaxy 170S型CO2培养箱，德国Eppendorf公司；SW－CJ－2D型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；Power Wave XS2型连续波长酶标仪，美国Bio Tek公司；R－1002型旋转蒸发仪，郑州长城科工贸有限公司；Advantage A10型超纯水器，美国Merck Millipore公司；KQ5200E型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；800B型离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 索骨丹总蒽醌和鞣质的提取

1）称取粉碎的索骨丹50g，按固液比1∶10（g∶mL，下同）溶于80%乙醇中，于45℃超声提取30 min，倒出上清液，沉渣再次提取，合并2次上清液，离心10min，将上清液浓缩至浸膏状，用等体积氯仿萃取2次，弃去沉淀和氯仿层，取上层干燥即得索骨丹总蒽醌粉末。

2）称取粉碎的索骨丹50g，按固液比1∶20溶于95%乙醇中，于50℃超声提取40min，倒出上清液，沉渣再次提取，合并2次上清液，抽滤，弃去残渣，将滤液减压蒸馏，馏分即为鞣质粗液；加入等体积乙醚萃取，分出水液层，再用等体积乙酸乙酯萃取，弃去沉淀，水液层及乙酸乙酯层经减压浓缩即得索骨丹鞣质。

1.2.2 THP－1细胞培养

THP－1细胞培养于含10%胎牛血清的THP－1专用培养基中，在37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱内培养，72h换液传代1次，取第5～15代细胞进行实验。将单核细胞接种于6孔板，每孔约106～107个细胞，加入含10%胎牛血清培养基5mL，含药组加入药物培养24h，加入脂多糖，继续培养12h，收集培养液上清待检测。

细胞处理及分组：（1）脂多糖组：加入脂多糖溶液，终浓度100ng·mL－1。（2）含药组：加入脂多糖溶液，终浓度100ng·mL－1；蒽醌溶液及鞣质溶液浓度分别为0.50mg·mL－1、0.75mg·mL－1、1.00mg·mL－1、1.25mg·mL－1及1.50mg·mL－1。（3）对照组：加入与脂多糖等体积的培养基。

1.2.3 培养液中细胞因子的检测

采用酶联免疫吸附实验（ELISA）方法检测，严格按照ELISA检测试剂盒说明书进行操作，在酶联免疫检测仪上测定450nm处各孔的吸光度值。

1.2.4 统计学处理

2 结果与讨论

2.1 索骨丹总蒽醌对细胞因子产生和释放的影响（表1）

表1 索骨丹总蒽醌对细胞因子产生和释放的影响Tab.1 The effects of anthraquinones fromRodgersia aesculifolia Batal.on the producing and releasing of cytokines

由表1可知：索骨丹总蒽醌对IL－1β、IL－6和TNF－α的产生和释放均有不同程度的抑制作用。当索骨丹总蒽醌浓度为0.50mg·mL－1时，其对IL－1β具有抑制作用，但无统计学意义，当浓度在0.75～1.50mg·mL－1范围时，其抑制作用具有统计学意义（P＜0.05）；索骨丹总蒽醌对IL－6的作用同样是低浓度（0.50mg·mL－1，0.75mg·mL－1）时虽有抑制作用，但无统计学意义，而当浓度在1.00～1.50mg·mL－1范围时，抑制作用具有统计学意义（P＜0.05）；索骨丹总蒽醌各浓度对TNF－α均有显著性抑制作用（P＜0.05）。由表1还可知，索骨丹总蒽醌对TNF－α的抑制作用最强，对IL－1β的抑制作用次之，而对IL－6的抑制作用最弱。

2.2 索骨丹鞣质对细胞因子产生与释放的影响（表2）

由表2可知，索骨丹鞣质各浓度均对TNF－α的产生和释放具有显著性抑制作用（P＜0.05）。

实验还发现，索骨丹鞣质对IL－1β和IL－6也有一定的抑制作用，但无统计学意义（P＞0.05）。

表2 索骨丹鞣质对细胞因子TNF－α产生与释放的影响Tab.2 The effects of tannins fromRodgersia aesculifolia Batal.on the producing and releasing of cytokine TNF－α

2.3 讨论

单核细胞来源于骨髓中的造血干细胞，在血液中停留2～3d后迁移到周围组织中，继续发育成为成熟的细胞。组织中的单核细胞称为组织巨噬细胞，单核巨噬细胞膜外有被脂多糖识别并结合的受体，当脂多糖与受体结合后，即活化细胞内的相应区域，激活了的单核组织细胞能生成并释放多种细胞毒素、干扰素和白细胞介素，参与机体防卫机制。此外，由于脂多糖的作用持续存在，进一步加强上述过程，从而出现正反馈调节［4］。

细胞因子是由多种细胞所分泌的小分子多肽的统称，参与调节细胞生长分化、调节免疫功能及参与炎症发生和创伤愈合等。现已确认的致炎细胞因子主要有TNF－α、IL－1β和IL－6等，这些细胞因子在生物损伤的病理过程中扮演重要的角色［5－6］。TNF－α来源广泛，体内的多种细胞，如单核巨噬细胞可通过脂多糖、细菌、病毒等刺激因素产生和释放TNF－α。TNF－α除具有强大的抗肿瘤作用外，还能促进IL－1、IL－2、IL－6的产生及分泌，诱发炎症反应。过量的TNF－α可破坏机体的免疫平衡，与其它炎症因子共同产生多种病理损伤。Ferrari等研究表明，肿瘤坏死因子系统与其它细胞因子共同构成了一个复杂的免疫网络，参与了类风湿关节炎、强脊炎、糖尿病等多种自身免疫性疾病的发生及发展［7］。IL－1在体内细胞来源广泛，几乎各种有核细胞都能产生IL－1。IL－1β主要由活化的单核吞噬细胞产生［8］。IL－1生物学效应非常重要的方面是参与炎症反应，会引发全身性症状如发热、肌消耗和急性期蛋白的合成，在局部时则引起组织炎症和破坏性病变［9］。IL－6是参与免疫调节和炎性反应的重要细胞因子之一，是宿主对感染和组织损伤所引起反应的主要介质。病毒、细菌感染均能诱导体内IL－6表达增加［10］。

实验中，索骨丹总蒽醌对IL－1β、IL－6和TNF－α的产生和释放均有不同程度的抑制作用，其中各浓度的总蒽醌对TNF－α均有抑制作用，且抑制程度强于对IL－1β、IL－6的作用。当总蒽醌浓度较低时，其对IL－1β、IL－6的抑制作用无显著性差异，浓度较高时抑制作用具有统计学意义，说明其作用与药物浓度具有一定的关系。索骨丹鞣质各浓度对TNF－α具有很强的抑制作用，而对IL－6和IL－1β的抑制作用较弱且无统计学意义。索骨丹治疗范围广，在治疗慢性消化系统疾病（如溃疡性结肠炎）及风湿性疾病中使用较多，而这些疾病的发病机制中都存在IL－1β、IL－6和TNF－α表达过高的情况，索骨丹的治疗作用可能部分是通过抑制炎症细胞因子的释放，进而减轻病变局部急慢性炎症反应、降低对组织的破坏、控制组织慢性增生而实现的。由此推断，其健脾燥湿、除痹止痛等功能可能对应地包括了对以上几种细胞因子的抑制作用。索骨丹所含化学成分复杂，其对炎症性疾病的疗效可能是某种成分发挥主要的作用，也可能是多种有效成分相互作用的结果，其确切的治疗机制还需要进行大量研究才能得以明确。

3 结论

观察索骨丹总蒽醌和鞣质对3种致炎细胞因子（IL－1β、IL－6、TNF－α）的影响，进而探讨其治疗炎症性疾病的部分机制。将体外培养的人单核细胞分为脂多糖组、不同浓度的含药组及阴性对照组。除对照组外，各组均加入相同量的脂多糖后继续培养12h，收集上清液，采用ELISA法通过酶标仪测得各组溶液的吸光度值，再计算出各组细胞因子的浓度。结果发现：索骨丹总蒽醌除0.50mg·mL－1组外，0.75～1.50mg·mL－1各组均能降低IL－1β含量（P＜0.05）；索骨丹总蒽醌在1.00～1.50mg·mL－1范围时可降低IL－6含量（P＜0.05）；索骨丹总蒽醌各浓度对TNF－α均有显著性抑制作用（P＜0.05）。索骨丹鞣质各浓度对TNF－α均有显著性抑制作用（P＜0.05）。表明，索骨丹提取物可通过减少IL－1β、IL－6和TNF－α的产生和释放而发挥治疗作用。

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