兴安白头翁小孢子发育与雄配子体形成的研究

全雪丽，金英花，吴松权，解明星，吕惠子

（1.延边大学农学院，吉林延吉 133000；2.延边大学药学院，吉林延吉 133000）

兴安白头翁小孢子发育与雄配子体形成的研究

全雪丽1，金英花1，吴松权1，解明星1，吕惠子2

（1.延边大学农学院，吉林延吉 133000；2.延边大学药学院，吉林延吉 133000）

采用常规石蜡切片法，对兴安白头翁小孢子不同发育时期的细胞学特征以及与花蕾大小的相关性进行研究。结果表明，兴安白头翁每朵花内包含数枚雄蕊，每个花药具有4个花粉囊，小孢子母细胞减数分裂属同时型，小孢子四分体属四面体型。成熟花粉粒属2-细胞型，并有3个萌发沟。花粉囊壁由4层细胞构成，即表皮、药室内壁、中层、绒毡层。绒毡层发育属腺质型（或分泌型），出现多核现象。兴安白头翁同一花蕾不同花药之间，同一花药不同花粉囊之间小孢子发育存在不同步性。

兴安白头翁；小孢子；雄配子体；发育

兴安白头翁[Pulsatilla dahurica（Fisch.）Spreng]是毛茛科白头翁属多年生草本植物，主要分布于我国东北地区。其干燥根可以入药，具有清热解毒、凉血止痢、燥湿杀虫功效。临床用于治疗细菌性痢疾、阿米巴痢疾、阴道滴虫等疾病[1-3]。现代药理研究表明，白头翁属植物还有抗微生物、抗蔗糖酶、抗肿瘤等活性。该属其他几个种（朝鲜白头翁、兴安白头翁等）也可作为白头翁入药[4]。

目前对白头翁研究主要集中在药理、化学成分分析等方面[5-10]。母锡金等仅对白头翁[Pulsatilla chinensis（Bunge）Regel]绒毡层的发育进行组织化学研究[11]；王金平对白头翁（P.chinensis）花部的形状及花粉萌发特性进行研究[12]；全雪丽等对朝鲜白头翁[Pulsatilla cernua（Thunb.）Berchtold Presl]小孢子发育时期与花器形态的相关性进行研究[13]。但关于兴安白头翁整个小孢子发生与雄配子体发生问题未见报道。文章探讨兴安白头翁小孢子发生过程及其与花蕾各部位形态特征相关性，旨在为兴安白头翁的栽培、育种以及生殖生物学提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料于2012年5月8～12日取自延吉市周边地区自然生长的兴安白头翁不同生长时期的花蕾。

1.2 方法

对采集的一部分新鲜材料进行调查（包括花蕾长度、花丝长度、花药颜色、花萼内外侧颜色变化等）；另一半材料用FAA固定液立即固定并保存带回实验室。采用常规石蜡切片法对不同大小花蕾进行切片，切片厚度10～12 μm，番红-固绿双重染色法染色，中性树胶封片，用OLYIMPUS显微镜观察，找出各发育时期，并进行显微照相。

2 结果与分析

2.1 兴安白头翁小孢子各发育阶段细胞学特征

兴安白头翁每朵花内有数枚雄蕊（见图版Ⅰ-1），每个花药具4个花粉囊（见图版Ⅰ-2）。随着花药的发育，4个孢原细胞通过平周分裂形成初生造孢细胞（内层）和初生周缘源细胞（外层），初生造孢细胞进行有丝分裂形成数个小孢子母细胞。小孢子母细胞大、排列紧密、核大（见图版Ⅰ-3～4）。小孢子母细胞减数分裂第一次分裂后没有发现形成细胞壁，无二分体时期（见图版Ⅰ-5～6）。之后进入减数分裂的第二次分裂，形成四面体型四分体（见图版Ⅰ-7），未观察到其他类型的四面体。减数分裂的胞质分裂属同时型。新形成的小孢子四分体被胼胝质壁所包围，随着胼胝质壁的消失，4个小孢子分散开（见图版Ⅰ-8）。

2.2 花药壁的发育

初生周缘细胞进行分裂、分化成花药壁。花药壁在发育初期各层之间无太大区别（见图版Ⅰ-3）。随着花粉母细胞进入减数分裂期，花粉囊壁的分化也慢慢形成，从外至内的细胞层依次为：表皮（1层）、药室内壁（1层）、中层（1～2层）、绒毡层（1层）（见图版Ⅰ-7）。在不同花药中，不同部位中层细胞层数不同，有的1层，有的2层。

表皮细胞是扁平状，细胞核大。为了适应花药的长大和伸长，表皮在发育过程中进行垂周分裂。花药成熟时表皮细胞仍然存在于最外层，但形态变得不规则（见图版Ⅰ-11～13）。

药室内壁在于表皮内侧，细胞核大。药室内壁细胞于四分体时期开始径向延长，体积逐渐变大，随后在2-细胞时期（见图版Ⅰ-11）出现纤维加厚，此加厚带为纤维素性质，因此这时的药室内壁亦称为纤维层。

中层位于药室内壁的内侧，由1层或2层细胞组成。中层细胞一直处于扁平状，花药成熟后药室内中层完全解体。

初期的绒毡层细胞和外侧的药壁细胞（表皮、药室内壁、中层）区别不大，细胞是单核的。随着花药的发育，绒毡层细胞体积逐渐变大，细胞质浓。从小孢子母细胞进入减数分裂开始一直到四分体时期，绒毡层发育达到最大值，出现2核至多核（见图版Ⅰ-3～7）。四分体时期后绒毡层细胞逐渐解体，当花粉成熟后，绒毡层细胞完全自溶（见图版Ⅰ-11～13）。绒毡层在整个发育过程中都处于原来的位置，属腺质绒毡层（或分泌型）。

最终成熟的花药壁只剩下表皮细胞和药室内壁两层。

2.3 兴安白头翁雄配子体发育

四分体时期的小孢子在胼胝质酶的作用下彼此分离，分离的小孢子游离在花粉囊中，这时细胞小，但细胞核很明显，位于细胞中央，这时处于单核中央期，形态上也不规则（见图版Ⅰ-8）；小孢子进一步发育后体积逐渐增大，形态上逐渐呈长椭圆形，且在后期花粉囊壁上出现三条萌发沟（见图版Ⅰ-9～10）；小孢子核移到花粉壁一侧成为单核靠边期花粉（见图版Ⅰ-9～10），随后小孢子核靠近花粉壁的位置进行有丝分裂，结果形成两个核，一个是体积较大的营养核，另一个是体积较小的生殖核（见图版Ⅰ-11），成熟时的二胞花粉，体积较小的生殖细胞变成弯月形（见图版Ⅰ-12）。在极个别的花粉囊中发现发育畸形的小孢子四分体，表现为四分体小孢子收缩、变形，无法辨别出细胞核与细胞质（见图版Ⅰ-14），与正常发育的四分体（见图版Ⅰ-7）有明显区别。

图版I 兴安白头翁小孢子发生及雄配子体的形成Plate I Microsporogenesis and male gametophyte formationin of P.dahurica(Fisch.)Spreng

2.4 兴安白头翁花器形态与小孢子发育相关关系

兴安白头翁花属于单生，生于花葶顶端，属两性花（见图版Ⅰ-1）。花萼6枚，花瓣状，卵形或狭卵形，紫色或粉色（随着花瓣的长大颜色逐渐变淡），外被长毛，内侧无毛；雄蕊多数（见图版Ⅰ-15～16）。花器形态调查如表1所示，兴安白头翁的花药由初期的淡绿色变为后期的黄色，花萼内侧颜色由初期的深紫色变为后期的粉色，花萼外侧颜色由初期的深紫色变为后期的粉色。花蕾长度大于2.0 cm时花瓣开放。

兴安白头翁小孢子发育与花器形态的相关性如表2所示。

表1 兴安白头翁花器形态调查Table 1 Investigation of flower organ morphology for P.dahurica(Fisch.)Spreng

表2 兴安白头翁小孢子发育与花器形态相关性Table 2 Correlation of microspore development and flower organ morphology for P.dahurica(Fisch.)Spreng

从表2中可知，在某一个花蕾长度梯度内出现几个不同时期小孢子，这是由于兴安白头翁一朵花内数枚雄蕊发育时期不一致导致（外侧雄蕊先熟，内侧雄蕊后熟）。

3 讨论与结论

兴安白头翁一朵花内包含很多雄蕊和雌蕊，每个雄蕊花药具有4个花粉囊，这与大多植物花药具备花粉囊数一致。

兴安白头翁胚胎学特征表现为：小孢子母细胞减数分裂的胞质分裂属同时型，小孢子四分体属四面体型，绒毡层发育属分泌型，成熟花粉粒属2-细胞花粉粒，花粉粒有3条萌发沟。兴安白头翁花药壁由4层细胞组成，表皮（1层）、药室内壁（1层）、中层（1～2层）和绒毡层（1层）。药室内壁在后期有纤维加厚现象。兴安白头翁与同属植物朝鲜白头翁[13]花粉发育特征基本一致。

研究表明，植物单倍体植株诱导率与所取材料花粉的发育时期有密切相关性，处于单核靠边期的花粉小孢子细胞易于诱导胚状体发生[14-15]。本试验观察发现，兴安白头翁小孢子各发育时期与花蕾长度具有相关性，但由于一朵花蕾内部多数雄蕊发育时期不同步，很难测量小孢子某一个时期花蕾长度。只能大概估测在花蕾长度0.6～0.7 cm时处于单核期花药较多，该阶段花药较易诱导胚状体。

植物有性生殖对于其生命延续和种群扩展起决定作用，该过程任何一个环节出现障碍，都会造成生殖失败。本研究对兴安白头翁减数分裂染色体行为进行观察，结果发现，其染色体行为无异常现象，且就其小孢子发育形态来看，不育可能性很小。

本研究发现，兴安白头翁极个别花粉囊中发现发育畸形的小孢子四分体，但后期很少发现发育畸形花粉粒，具体原因有待于进一步研究。兴安白头翁一朵花蕾内部数枚雄蕊之间，同一花药不同花粉囊之间出现小孢子发育不同步现象。赵桦等认为这是植物对延长传粉期的适应性表现[16]。

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Study on microspore development and male gametophytes formation ofPulsatilla dahurica(Fisch.)Spreng

QUAN Xueli1,JIN Yinghua1,WU Songquan1, XIE Mingxing1,LV Huizi2(1.School of Agricultural,Yanbian University,Yanji Jilin 133000,China; 2.School of Pharmacy,Yanbian University,Yanji Jilin 133000,China)

The paper studied cytological characteristics of microspores during different developments and correlations with bud size forPulsatilla dahurica(Fisch.)Spreng by the methods of paraffin section.The results showed that each flower had several stamens,each anther had four pollen sacs, the microspore mother cells belonged to the simultaneous type of meiosis,and microspore tetrads were tetrahedral.The mature pollens belonged to the two-cell type with three germination aperture;the pollen sac wall was composed of four layers,epidermis,endothelium,middle layer,and tapetum;and the tapetum belonged to glanduar tapetum type(or secretory type)with multinucleate phenomenon.There was asynchronous for microspore development of the same buds in different anthers and the same anthers in different pollen sacs.

Pulsatilla dahurica(Fisch.)Spreng;microspore;male gametophyte;development

Q944.57

A

1005-9369（2014）05-0059-05

2013-12-03

吉林省中医药管理局中医药科技项目（08sys-101）

全雪丽（1973-），女，副教授，博士，研究方向为植物学解剖与分类。E-mail:qxl2000@aliyun.com

时间2014-5-12 9:01:17[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140512.0901.016.html

全雪丽,金英花,吴松权,等.兴安白头翁小孢子发育与雄配子体形成的研究[J].东北农业大学学报,2014,45(5):59-63.

Quan Xueli,Jin Yinghua,Wu Songquan,et al.Study on microspore development and male gametophytes formation ofPulsatilla dahurica(Fisch.)Spreng[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(5):59-63.(in Chinese with English abstract)