止痛止痒类中成药中非法添加化学药物的快速鉴定方法

吴晓敏， 史大军* ， 王明娟， 李 奎， 孙 熹， 唐新月

(1. 三峡食品药品检验检测中心，湖北宜昌443005;2. 中国食品药品检定研究院，北京100050)

良好的中药制剂因为安全、不良反应少，长期以来受到人们信赖，是中国传统医药发展的优势。但多种中药制剂与化学药相比，往往作用温和，起效慢。为了增强中药制剂短期疗效，将一些化学药品加入到治疗风湿、类风湿等疾病的止痛止痒类的中成药和保健食品中［1］，由于这些化学药物都有明显的不良反应，患者在不知情的情况下长时间使用后，有可能产生严重的后果，危害身体健康。中药制剂的非法添加已引起相关部门高度重视，但由于中药制剂中所含成分复杂、质量标准还不完善，国内虽有一些相关的文献报道［2-3］，但目前还没有鉴定非法添加微量糖皮质激素和镇痛药的法定方法，为了快速准确地鉴定出药物中是否非法添加此类化学药成分，本实验建立了以TLC 方法进行初筛，对疑似样品进一步采用HPLC 方法确证，一次能够测定6 种糖皮质激素(醋酸泼尼松、醋酸氟轻松、醋酸地塞米松、醋酸可的松、倍他米松、泼尼松)和2 种镇痛药(双氯芬酸钠、吲哚美辛)的筛查方法，并用市售的14 种止痛止痒类中成药对该法进行验证，证实该方法快速、简便、专属性强、可满足基层药品现场打假的需求。

1 仪器与试药

Waters 高效液相色谱仪，配备型号为2998 的二极管阵列检测器;(高效)硅胶G 薄层板，青岛海立倍精细硅胶化工有限公司(批号20100818);(高效)硅胶GF254薄层板，天津思利达科技有限公司(批号100628)。

醋酸泼尼松(批号100012-200706)、醋酸氟轻松(批号10010-02061)、醋酸地塞米松(批号100122-200805)、 倍 他 米 松 (批 号 100118-200403)、醋酸可的松(批号100123-200303)、泼尼松(批号100199-201002)、双氯芬酸钠(批号100334-200302)、吲哚美辛(批号0258-9501)对照品均由中国食品药品检定研究院提供;二氯甲烷、甲醇、乙醚、正己烷、乙酸乙酯均为分析纯;水为纯化水;四氮唑蓝为进口试剂(东京化成工业株式会社)。

14 种止痛止痒类中成药均为市售:克痹骨泰胶囊 (批号 100201)，风湿安泰片 (批号20080401)，风痛安胶囊(批号20080501)，豨莶风湿胶囊(批号090408)，清新百合紫苏胶囊(批号20110102)，风痛片(批号110302)，风湿马钱片(批号20100105)，麝香关节止痛膏 (批号121002)，骨友灵贴膏(批号120701)，万通筋骨贴 (批 号 120813)，复 方 樟 脑 乳 膏 (批 号201207030)，好百夫康软膏(批号120701)，腰间盘突出止痛贴(批号2012301)，风湿骨痛贴(批号20111201)。

2 薄层色谱初筛方法

2.1 薄层色谱条件

2.1.1 薄层色谱方法1 (用于鉴别糖皮质激素类的6 种化学药品) (高效)硅胶G 薄层板;展开剂为二氯甲烷-乙醚-甲醇-水(385 ∶70 ∶14 ∶2);点样量4 μL;分别量取10 mL 0.3%四氮唑蓝甲醇溶液与30 mL 12%氢氧化钠甲醇溶液，临用时混匀作为显色剂。分别取供试品溶液和对照品溶液1 各4 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，展开后，晾干，置105 ℃加热15 min，喷以四氮唑蓝显色剂，检视［4］。

2.1.2 薄层色谱方法2 (用于鉴别双氯芬酸钠和吲哚美辛2 种化学药品) (高效)硅胶GF254薄层板;展开剂为正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(30 ∶10 ∶0.5);点样量4 μL;置紫外光灯254 nm 下检视。分别取供试品溶液和对照品溶液2 各4 μL，点于同一硅胶GF254薄层板，展开后，晾干，置紫外光灯254 nm 下检视。

2.2 供试品溶液的制备

2.2.1 胶囊剂和片剂 取1 次口服用量的供试品(片剂研磨后取细粉适量)，加甲醇10 mL，超声振摇提取(150 W，55 kHz)15 min，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.2 软膏剂 取样品1 g，加甲醇20 mL 微温至50 ℃，振摇溶解，充分冷却后过滤，取滤液作为供试品溶液。

2.2.3 贴膏剂和膏药 取样品2 片，剪成窄条，除去盖衬，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，加热回流1 h，放冷，过滤，滤液蒸干浓缩至10 mL，作为供试品溶液。

2.3 对照品溶液的制备

2.3.1 糖皮质激素类对照品溶液 分别称取醋酸泼尼松、醋酸氟轻松、醋酸地塞米松、倍他米松、醋酸可的松、泼尼松对照品各20 mg，置同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，作为对照品溶液1;另外，取醋酸泼尼松、醋酸氟轻松、醋酸地塞米松、倍他米松、醋酸可的松、泼尼松对照品各20 mg，分别置6 个10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为醋酸泼尼松、醋酸氟轻松、醋酸地塞米松、倍他米松、醋酸可的松、泼尼松对照品溶液。

2.3.2 双氯芬酸钠和吲哚美辛对照品溶液 取双氯芬酸钠对照品和吲哚美辛对照品各20 mg，置同一10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液2;取双氯芬酸钠对照品和吲哚美辛对照品各20 mg，分别置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为双氯芬酸钠对照品溶液和吲哚美辛对照品溶液。

2.4 阳性对照溶液的配制 取1 次口服用量的供试品，分别加入步骤“2.3”项所得的对照品溶液5 mL，按“2.2”项下制备，作为供试品阳性对照溶液。

3 高效液相色谱确证方法

3.1 色谱条件 SunFire C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm;Waters 公司);柱温25 ℃;流动相A 为0.5%HAc 溶液-四氢呋喃(100 ∶1)，流动相B 为乙腈-0.5% HAc 溶液-四氢呋喃(80 ∶20 ∶1)，按表1 进行梯度洗脱;检测波长254 nm，二极管阵列检测器检测，扫描波长范围190 ～450 nm［6-7］;体积流量1 mL/min。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Linear gradient manmer

3.2 溶液的制备

3.2.1 对照品溶液 精密称取醋酸泼尼松、醋酸氟轻松、醋酸地塞米松、倍他米松、醋酸可的松、泼尼松对照品各25 mg，分别置25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液3;精密称取双氯芬酸钠对照品、吲哚美辛对照品各25 mg，分别置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解后稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液4。分别精密量取上述2 种对照品贮备液各2 mL，置50 mL 量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

3.2.2 供试品溶液

3.2.2.1 胶囊剂和片剂 取1 次口服剂量的供试品(片剂研磨后取细粉适量)，置50 mL 量瓶，加甲醇约20 mL，超声振摇提取15 min，加甲醇稀释至刻度，混匀，过滤，取续滤液为供试品溶液。

3.2.2.2 贴膏剂和膏药 取供试品贴膜2 片，剪成窄条，除去盖衬，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，加热回流1 h，放冷，用甲醇补足减失的质量，过滤，取续滤液作为供试品溶液［2］。

4 结果与讨论

4.1 薄层色谱初筛方法的建立

4.1.1 薄层色谱方法1 分别吸取醋酸泼尼松、醋酸氟轻松、醋酸地塞米松、倍他米松、醋酸可的松、泼尼松对照品溶液和对照品溶液1 各4 μL，点于同一薄层板上，按“2.1.1”项薄层色谱方法1 进行系统适用性试验，置预先放有展开剂的层析缸中，展开，取出，晾干，显色后检视，结果见图1A。可见各个对照品的比移值(从左至右)分别为0.25、0.64、0.54、0.47，0.72 和0.15，均在0.15 ～0.8 之间，各个斑点可清晰分离。分别吸取对照品溶液1 各8、6、4、2、1 μL 进行试验，确定方法的最低检出限，其中点样量1 μL 时斑点仍可清晰辨认，醋酸泼尼松、醋酸氟轻松、醋酸地塞米松、倍他米松、醋酸可的松、泼尼松的最低检测质量浓度均约为0.1 mg/mL。分别吸取供试品溶液、对照品溶液和供试品阳性对照溶液各4 μL，进行试验，结果见图1B。可见在与对照品溶液斑点对应处供试品溶液无斑点显现，供试品阳性对照溶液显现的斑点与对照品溶液的斑点一致，即方法可以筛查出样品中非法添加的化学药。

图1 系统适用性实验(A)和实际样品检测结果(B)Fig.1 TLC of system suitability test (A)and TLC of the actual sample testing results (B)

4.1.2 薄层色谱方法2 比较了二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸(30 ∶10 ∶0.5)、二氯甲烷-乙醚-甲醇-水(385 ∶70 ∶14 ∶2)和正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(30 ∶10 ∶0.5)3 种展开剂［5］，前2 种展开剂分别出现了拖尾和无法分离的现象，在正己烷系统展开剂中，2 个对照品的比移值分别为0.42 和0.55，且对照品的斑点清晰分离见图2A，所以采用了正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(30 ∶10 ∶0.5)作为展开剂。分别吸取上述对照品溶液8、6、4、2、1 μL点于薄层板上，其中点样量1 μL 时，对照品的斑点清晰辨认，双氯芬酸钠和吲哚美辛的最低检测浓度约为0.1 mg/mL。分别吸取供试品溶液、对照品溶液和供试品阳性对照溶液各4 μL 进行试验，结果见图2B，结果表明，样品基质不干扰目标化合物(双氯芬酸钠和吲哚美辛)的测定。

图2 系统适用性实验(A)和实际样品检测结果(B)Fig.2 TLC of system suitability test (A)and TLC of the actual sample testing results (B)

由于醋酸泼尼松和醋酸地塞米松对照品斑点距离较近，实验中发现乙醚的质量影响两斑点的分离。本实验在室温20 ～25 ℃环境与在 (10 ±1)℃、(15 ±1)℃及(30 ±1)℃的环境下试验结果一致，只是随着温度降低展开时间延长。如采用高效薄层板，展开时间较普通硅胶薄层板短，规格为10 cm ×20 cm 的普通薄层板展开时间约为60 ～70 min，规格为10 cm ×10 cm 的高效薄层板展开时间约为20 min 且显色更加明显、均匀易辨识。

对贴膏剂和膏药的前处理方法直接影响检测结果。曾尝试超声提取的方法，超声时间分别为30 min和60 min，但腰间盘止痛贴采用超声方法所得溶液中成分含有量仅为回流提取方法的40%，故最终选用了加热回流的提取方法。

4.2 高效液相色谱确证方法的建立

4.2.1 流动相的选择 预实验结果发现:流动相中加入四氢呋喃能加强洗脱，调整峰形;另外，双氯芬酸钠和吲哚美辛在水相中会出现明显拖尾，无法检出，加入适量浓度的冰醋酸能调整双氯芬酸钠与吲哚美辛的色谱峰的峰形［8-10］。当冰醋酸为0.5%时，上述2 个色谱峰无拖尾现象，且各组分均能完全分离，分离度均在1.5 以上，见图3。在所建立的色谱系统条件下，各对照品的出峰顺序依次为泼尼松、倍他米松、醋酸泼尼松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、醋酸氟轻松、吲哚美辛、双氯芬酸钠，保留时间分别为:13、17、21、22、24、31、34 和35 min;分离度分别为11.8、14.5、1.9、6.7、13.2、6.9、2.0。

图3 对照品溶液的色谱图Fig.3 Chromatogram of reference solution

4.2.2 方法学验证

4.2.2.1 精密度试验 取对照品溶液重复进样5次，记录色谱图，测得8 种对照品的保留时间变化为0.1 min，8 种对照品峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.7% ～1.1%。

4.2.2.2 重复性试验 取同一阳性供试品5 份，制备供试品溶液分别测定峰面积，结果添加成分含有量为0.62 mg/粒，RSD (n=5)为1.7%，表明本法重复性良好。

4.2.2.3 稳定性试验 取对照品溶液和阳性供试品溶液于0、4、8、12、24 h 分别进样测定，记录色谱图，对照品溶液中各成分峰面积的RSD 均小于1.5%，供试品溶液中峰面积的RSD 为1.2%，表明溶液在24 h 内稳定。

4.2.2.4 线性范围和最低定量限检出限 取6 种糖皮质激素对照品贮备液分别稀释成0.4、0.2、0.1、0.08、0.06、0.04、0.02 mg/mL 的混合对照溶液依次进样，以峰面积对溶液质量浓度作标准曲线，另取双氯芬酸钠和吲哚美辛对照贮备液分别稀释 成 2.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.08、0.06、0.04 mg/mL 的混合对照溶液依次进样，以峰面积对溶液质量浓度作标准曲线，结果泼尼松为Y =3.66 ×10-5x+0.902 4，r=0.999 9;倍他米松Y=4.15 ×10-5x +0.832 8，r =0.999 9;醋酸泼尼松Y=4.43 ×10-5x+0.120 7，r=0.999 9;醋酸可的松Y=4.04 ×10-5x +0.622 6，r =0.999 9;醋酸地塞米松Y=4.47 ×10-5x+0.874 0，r=0.999 9;醋酸氟轻松Y=5.62 ×10-5x +0.414 8，r =0.999 9;双氯芬酸钠Y=7.96 ×10-5x +3.149 5，r=0.999 9;吲哚美辛Y=2.93 ×10-5x -7.220 0，r =0.999 8。8 种对照品均呈线性关系且相关系数(r)均大于0.999，线性关系良好。取混合对照溶液稀释后按试验方法检测，得到各组分的定量限(S/N≥10)，醋酸氟轻松对照品为2 μg，其余对照均为1 μg。

4.2.2.5 加样回收试验 阴性加标溶液的制备:取同一阴性供试品6 份，另精密称取对照品按“3.2.1”项下制备对照品贮备液，将样品按供试品方法项下制备并分别加入上述对照品贮备液2 mL，用外标法进行测定并计算回收率，平均回收率(n =6)为泼尼松99.4%，RSD 为0.3%;倍他米松100.5% ，RSD 为0.5%;醋酸泼尼松98.3%，RSD 为0.5%;醋酸可的松98.5%，RSD为0.7%;醋酸地塞米松99.7%，RSD 为0.6%;醋酸氟轻松99.1%，RSD 为0.5%;吲哚美辛99.6%，RSD 为0.6%;双氯芬酸钠99.2%，RSD为0.4%，表明方法的准确性良好。

4.2.2.6 阴性样品的验证 取风湿安泰片、风痛安胶囊、豨莶风湿胶囊、风痛片、风湿马钱片、麝香关节止痛膏、骨友灵贴膏、万通筋骨贴、好百夫康软膏用薄层方法检测的阴性供试品。按“3.2.2”项下制备供试品溶液，分别精密量取供试品溶液10 μL 注入液相色谱进行检测，均未见干扰色谱峰。

4.3 样品的筛查及确证

4.3.1 采用所建的薄层色谱方法1 对克痹骨泰胶囊、风湿安泰片、风痛安胶囊等样品进行筛查，结果发现1 批样品克痹骨泰胶囊疑似添加了醋酸泼尼松或醋酸可的松，另1 批阳性样品清新百合紫苏胶囊添加了醋酸泼尼松，其他样品均未发现添加现象;采用所建的薄层色谱方法2 对上述样品进行了筛查，结果发现2 例添加双氯芬酸钠的阳性品种腰间盘突出止痛贴和风湿骨痛贴，其他样品未发现添加现象，见图4。

4.3.2 HPLC 方法确证 对TLC 筛查得到的可疑供试品与阳性供试品采用HPLC 方法进行进一步的确证。

图4 克痹骨泰胶囊(A)、清新百合紫苏胶囊(B)、腰间盘突出止痛贴(C)和风湿骨痛贴(D)的薄层色谱图Fig.4 TLC of Kebi Gutai Capsules (A)、Qinxin Baihe Capsules (B)、Yaojianpan Tuchu Zhitong Plaster(C)and Fengshi Gutong Plaster (D)

可疑供试品 取薄层色谱系统1 筛选出的可疑供试品克痹骨泰胶囊，按高效液相色谱确证方法“3.2.2”项下制备供试品溶液，精密量取供试品溶液10 μL 注入液相色谱进行检测，其中克痹骨泰胶囊在21 min 与22 min 均出现色谱峰，但通过供试品光谱图与对照品光谱图比较，见图5、图6，可见克痹骨泰胶囊中的未知峰不是醋酸泼尼松与醋酸可的松［11］。

阳性供试品 将薄层方法初筛得到的阳性品种清新百合胶囊、腰间盘突出止痛贴和风湿骨痛贴按“3.2.2”项下制备供试品溶液，分别精密量取供试品溶液10 μL 注入液相色谱进行检测，确证了清新百合紫苏胶囊添加了糖皮质激素，其中21 min所得色谱峰的保留时间与对照品光谱图中醋酸泼尼松相同，光谱特征也一致。同时另外2 个阳性品种的腰间盘突出止痛贴和风湿骨痛贴也添加了双氯芬酸钠，其保留时间和光谱特征也一致，见图6。

薄层色谱系统检出的3 个阳性样品，经HPLC法进行确证和定量测定，结果为:清新百合紫苏胶囊中添加了醋酸泼尼松，含有量约为0.6 mg/粒;腰间盘突出止痛贴中添加了双氯芬酸钠，含有量约为3.5 mg/贴;风湿骨痛贴中添加了双氯芬酸钠，含有量约为2.5 mg/贴。

图5 醋酸泼尼松、醋酸可的松、双氯芬酸钠的色谱图(A)和光谱图(B)Fig.5 Chromatograms (A)and spectrogram (B)of reference substances of Prednisone acctate，Crotisone acetate，Diclofenac sodium

图6 样品的色谱图和光谱图Fig.6 Chromatograms and spectrogram of samples

4.4 结论 采用薄层色谱法和HPLC 法结合的方式，能够快速、准确地筛查出止痛止痒类中成药制剂中非法添加的8 种常见抗炎化学药物(醋酸泼尼松、醋酸氟轻松、醋酸地塞米松、醋酸可的松、倍他米松、泼尼松、双氯芬酸钠、吲哚美辛)的品种和量。该方法准确，灵敏，适用于不同检验机构操作，特别是对基层药监部门快速打击假劣药品方面发挥重要作用。

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