丹红注射液中丹酚酸B 在大鼠体内的药代动力学研究

唐进法， 宋云香， 鲁 静， 李学林

(河南中医学院第一附属医院 药学部，河南 郑州450000)

丹红注射液是由丹参、红花两味中药按科学配方提取，制成的中药复方制剂，能够明显缓解心绞痛症状，改善心肌缺血情况，临床上主要用于治疗肺心病、冠心病、心绞痛、慢性脑供血不足等疾病［1］。丹酚酸B 是丹参中的主要酚酸类成分，具有保护心脑血管缺血-再灌注损伤、抗纤维化、促进神经干细胞增殖分化等作用［2-5］。测定不同种属动物血浆中丹酚酸B 的方法均有所报道［6-11］。王小平等［12-13］采用HPLC-MS 法测定了大鼠静脉注射丹红注射液后血浆中丹酚酸B 的质量浓度，但所需仪器昂贵，分析时间长。本实验建立了测定大鼠血浆中丹酚酸B 的超高效液相色谱(UPLC)法，方法简便、准确、快速，适用于大鼠静脉注射丹红注射液后丹酚酸B 药代动力学行为的研究。

1 材料与方法

1.1 仪器 H-CLASS 超高效液相色谱仪(美国waters 公司);电子分析天平 (德国赛多利斯)，TGL-16B 离心机(上海安亭科学仪器厂)，QL-901漩涡混合器 (海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，BF-2000 氮气吹干仪(北京八方世纪科技有限公司)。

1.2 药品与试剂 丹红注射液(菏泽步长制药有限公司，批号12031018)，丹酚酸B (纯度大于98.0%，中国药品生物制品检定所，111562-201111)，甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

1.3 实验动物 Wistar 大鼠，SPF 级，体质量240 ～260 g，雌雄各半，山东鲁抗动物中心提供。动物生产许可证号:SCXK 鲁20080002。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 BEH Shield RP18色谱柱 (2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，BEH Shield RP18保护柱(2.1 mm ×5 mm，1.7 μm);流动相甲醇-乙腈-0.5%甲酸水溶液(29 ∶10 ∶61);体积流量0.3 mL/min;检测波长286 nm;柱温30 ℃;进样量5 μL。

2.2 溶液制备 精密称定丹酚酸B 对照品3.41 mg，置于10 mL 量瓶中，加75%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成丹酚酸B 为0.341 mg/mL的对照品贮备液。取丹酚酸B 对照品贮备液适量，分别用75% 甲醇稀释成含丹酚酸B 0.170 5、0.341、0.682、 1.705、 3.410、 6.820、 17.05、34.10 μg/mL 的标准系列溶液。对照品贮备液及标准系列溶液于4 ℃冰箱保存。

2.3 血浆样品处理 取血浆200 μL，加入75%甲醇200 μL，2 mol/L 盐酸溶液100 μL，1%醋酸溶液100 μL，再加入乙酸乙酯1 mL，涡旋1 min，15 000 r/min 离心15 min，吸取有机层于20 ℃氮气流下吹干。残留物用75%甲醇100 μL 溶解，涡旋1 min，15 000 r/min 离心15 min，吸取上清液5 μL 测定。

2.4 方法学确证

2.4.1 专属性 取大鼠空白血浆200 μL，按“2.3”项方法操作，所得色谱图见图1A;将0.170 5 μg/mL 的丹酚酸B 对照品溶液加入大鼠空白血浆，除不加75% 甲醇200 μL 外，其余按“2.3”项方法操作，所得色谱图见图1B;取大鼠尾静脉给药2 h 后的血浆样品200 μL，按“2.3”项方法操作，所得色谱图见图1C。结果显示，血浆中的内源性物质不干扰样品的测定。

2.4.2 标准曲线与最低下限 取空白血浆200 μL，分别加入丹酚酸B 对照品标准系列溶液200 μL，得到质量浓度为0.170 5、0.341 0、0.682 0、1.705、3.410、6.820、17.05 和34.10 μg/mL 的血浆标准样品，除不加75%甲醇200 μL 外，其余按“2.3”项方法操作，进样分析。以对照品质量浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，用加权最小二乘法(W =1/X2)计算回归方程和相关系数。得到丹酚酸B 的标准曲线为y = 34 623.913x+240.466，r=0.992 0。结果表明，丹酚酸B 在0.170 5 ～31.40 μg/mL 的质量浓度范围内线性关系良好，定量下限为0.170 5 μg/mL。

2.4.3 准确度与精密度 取空白血浆200 μL，分别加入0.341 0、3.410、27.28 μg/mL 的丹酚酸B对照品溶液，得到高、中、低不同质量浓度的血浆质控样品，除不加75%甲醇200 μL 外，其余按“2.3”项方法操作，进样分析。每个质量浓度6样本，连续测定3 d，计算得到方法准确度与精密度，结果见表1。

图1 空白血浆(A)、空白血浆加入0.170 5 μg/mL 的丹酚酸B 对照品溶液(B)、大鼠给药2 h 后血浆(C)的色谱图Fig.1 UPLC chromatograms:A (blank plasma sample);B (blank spiked with 0.170 5 μg/mL standard salvianolic acid B solution );C (rat plasma sample collected 2 h after intrarenous administration)

表1 大鼠血浆中丹酚酸B 的准确度和精密度Tab.1 Accuracy and precision of salvianolic acid B in rat plasma

2.4.4 回收率测定 取空白血浆200 μL，分别加入0.341 0、3.410、27.28 μg/mL 的丹酚酸B 对照品溶液，得到高、中、低不同质量浓度的血浆质控样品，除不加75%甲醇200 μL 外，其余按“2.3”项方法操作，进样分析，另取相应质量浓度对照品溶液 (0.341 0、3.410、27.28 μg/mL)，进 样10 μL，将所得峰面积比较，计算提取回收率分别为(90.0 ±6.4)%、 (90.3 ±4.3)%和(92.1 ±2.5)%。

2.5 药代动力学研究

2.5.1 样品采集及测定 Wistar 大鼠6 只，雌雄各半，实施颈静脉插管手术，插管后饲养3 d，给药前禁食12 h，自由饮水。大鼠以10 mL/kg (含丹酚酸B 0.336 5 mg/mL)的剂量尾静脉注射丹红注射液，分别于给药前及给药后 0.016 7、0.083 3、0.167、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2 h经导管取血约0.5 mL，置肝素化离心管中，在4 ℃下4 500 r/min 离心15 min，分离血浆，于-80 ℃冰箱中保存待测。

血浆样品按“2.3”项处理，取上清液分析测定，将所测得色谱峰面积代入标准曲线，求出不同时间点的血药浓度。

2.5.2 药代动力学参数 大鼠尾静脉注射丹红注射液后，丹酚酸B 的平均血药浓度-时间曲线见图2。采用DAS2.1.1 软件计算主要的药代动力学参数，结果见表2。

图2 大鼠单剂量静脉注射丹红注射液后血浆中丹酚酸B平均血药浓度-时间曲线Fig.2 Mean plasma concentration-time profile of salvianolic acid B after intravenous administration of Danhong Injection to rats

表2 大鼠单剂量静脉注射丹红注射液后血浆中丹酚酸B 药代动力学参数Tab.2 Pharmacokinetic parameters of salvianolic acid B in rats after intravenous administration of Danhong Injection

3 讨论

本实验前期曾尝试使用甲醇、乙腈等试剂沉淀蛋白来处理血浆，但所得样品色谱图中，内源性干扰峰及杂质都较多，检测灵敏度较差，故改用液液萃取法。考察了中性及酸性(1 moL/L 盐酸溶液+1%醋酸溶液、2 moL/L 盐酸溶液+1%醋酸溶液)条件下血浆中丹酚酸B 的提取回收率，确定以2 moL/L 盐酸溶液和1%醋酸溶液为酸化剂。接着比较了不同提取溶剂(丙酮、乙酸乙酯)对血浆中丹酚酸B 提取回收率的影响，最终选择乙酸乙酯为提取溶剂。

中药制剂中含有多种化学成分，成分间可能会发生相互作用，使Tmax、Cmax或AUC 等药代动力学参数发生改变［9，14］，目前，关于丹红注射液中各成分相互协调、发挥综合协同作用的研究报道较少，今后，将多开展丹红注射液中多组分药代动力学的研究。

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