海带多糖对高脂血症小鼠血清瘦素水平及瘦素受体表达的影响

张进松，辛 辉*，李晓丹，段德麟

1青岛大学医学院附属医院心内科，青岛 266003;2 青岛大学医学院中西医结合中心，青岛 266021;3 中国科学院海洋研究所，青岛 266071

瘦素(Leptin)主要由白色脂肪组织合成和分泌，是一种多肽类激素，与其受体结合后可发挥调节食欲、脂质代谢的作用［1］。研究表明［2］，许多肥胖患者，尤其是伴随高脂血症的肥胖患者血清瘦素水平增高，提示存在瘦素抵抗。海带多糖主要由褐藻胶(algin)、褐藻糖胶(fucoidan)、褐藻淀粉(1aminaran)组成，具有提高机体免疫力、抗衰老、抗氧化应激、抗肿瘤等多种生物学活性［3］。研究证实［4］，海带多糖可以降低血脂及瘦素水平，但其作用机制尚不明确。本研究通过建立高脂血症小鼠动物模型，应用海带多糖药物干预，检测小鼠血清瘦素及下丘脑瘦素受体的表达水平，探讨海带多糖对血脂水平的调节作用和可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型及分组

清洁级健康雄性昆明小鼠80 只(体质量22～27 g)，由青岛市药物检验所动物中心提供［SCXK(鲁)20110010］。适应性喂养5 d，随机取10 只小鼠处死取血测定正常空腹血脂水平。再随机取20只作为正常对照组，给予普通饲料喂养，剩余50 只为高脂饲料组，给予高脂饲料(配比:普通饲料59%，蔗糖20%，猪油10%，蛋黄粉10%，胆酸钠1%)喂养。4 周后随机取高脂饲料组小鼠10 只处死测定血脂水平，以血清甘油三酯、胆固醇水平高于正常水平2个标准差作为高脂血症模型建立成功的标志。将造模成功的40 只小鼠随机分为高脂模型组、海带多糖治疗组，各20 只。

1.2 干预措施

正常对照组继续予以普通饲料喂养，高脂模型组和海带多糖治疗组改为普通饲料喂养。用生理盐水将海带多糖(中国科学院海洋研究所提供)配制成300 mg/mL 混合液，根据前期研究［5］所得的有效剂量(3.00 g/kg)灌胃治疗，每日1 次，连续2 周。对照组和模型组同步给予等量生理盐水。

1.3 指标检测

1.3.1 血脂检测

小鼠禁食12 h 经心脏取血1 mL 置于红头真空采血管内静置10 min，4000 rpm 离心10 min，分离血清，日立7600 生化分析仪测血脂水平，剩余血清-20℃保存。

1.3.2 血瘦素检测

取上述血清标本，室温复溶，按瘦素(Leptin)酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(T-32203，安迪科技公司，美国)说明操作，酶标仪(BioTek 公司ELx800型号，美国)在450 nm 处测定吸光度值，根据样品吸光值在标准曲线坐标上找出对应的血清Leptin(μg/L)水平。

1.3.3 免疫组化法检测下丘脑OBR 水平

每组随机取小鼠5 只经心脏取血后用输液器针头刺入左心室内，剪破右心耳，NS 50 mL 冲洗，4%多聚甲醛溶液50 mL 灌注，取脑组织，生理盐水洗涤，4%多聚甲醛溶液固定2 h，蒸馏水浸泡4 h，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，连续5 μm切片，贴于多聚赖氨酸处理的载玻片上。石蜡切片脱蜡至水，按试剂盒说明书操作(兔抗小鼠OBR 一抗由abcam 公司提供，免疫组化试剂盒(SP-90001，北京中杉生物公司)，DAB 显色，苏木精复染，显微镜下观察细胞浆或细胞膜出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。在400 倍光镜下随机观察5个不重叠的视野，Image-Pro Plus 软件分析组织OBR 吸光度值(A)，以阳性细胞A 减去背景A 表示OBR 表达强度。

1.3.4 Western blot 检测OBR 蛋白表达

每组随机取小鼠7 只，生理盐水50 mL 经心脏灌注后，取下丘脑组织，提取总蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白浓度，SDS-PAGE 电泳分离蛋白，半干法转膜，加一抗(OBR，Ab5593，1:2000;GAPDH，TA-08，1:10000)、二抗(Ab6721，1:5000)孵育，A、B 液显影，Vilber Fusion FX7 系统成像，Quantity One 软件图像分析。以目的蛋白OBR(125kD)与内参GAPDH(36kD)灰度值的比值表示OBR 的相对含量。

1.3.5 RT-PCR 检测OBR mRNA 量

剩余小鼠取下丘脑方法同上，应用Trizol 试剂(Invitrogen 公司)提取总RNA，紫外分光光度计(K5500，北京凯奥科技公司)测RNA 丰度。逆转录:OBR 上游引物5'-AAC TCA ACT ACG CTC TTC TG-3'，下游引物5'-CCA TCA TCT GTG ACT TCC AT-3'，产物长度142 bps;内参GAPDH 上游引物5'-AAC CTG CCA AGT ATG ATG A-3'，下游引物5'-GGA GTT GCT GTT GAA GTC-3'，产物长度119 bps［6］。扩增基因:95 ℃预变性10 min，98 ℃变性10 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，35个循环，72℃延伸10 min(Takara DRR014A PrimeScript?RTPCR Kit)。取适量扩增产物，2%琼脂糖凝胶电泳(110V/40A)30 min，溴化乙锭染色，Vilber Lourmat系统成像，Quantity One 软件分析PCR 产物条带灰度值。以目的基因与内参GAPDH 灰度值的比值表示OBR 基因的相对丰度。

1.4 统计学处理

采用SPSS17.0 软件进行统计学分析，结果以均数±标准差()表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t 检验。

2 实验结果

2.1 血脂(TG、TC、LDL)、血清Leptin 水平

血脂及血清Leptin 水平组间有显著性差异(FTG=96.80，FTC=115.30，FLDL=41.83，FLeptin=13.51，P＜0.01)，其中模型组较对照组显著升高(tTG=11.82，tTC=12.38，tLDL=7.74，tLeptin=5.24，P＜0.01)，治疗组较模型组均显著降低(tTG=9.90，tTC=11.80，tLDL=6.50，tLeptin=3.98，P＜0.01)，治疗组与对照组无显著性差异(tTG=2.00，tTC=1.37，tLDL=1.11，tLeptin=1.09，P ＞0.05)。见表1。

表1 各组小鼠血脂、血清Leptin 水平(，n=15)Table 1 Blood lipid and serum leptin level of different groups

表1 各组小鼠血脂、血清Leptin 水平(，n=15)Table 1 Blood lipid and serum leptin level of different groups

a与对照组比较，P＜0.01;b 与模型组比较，P＜0.01;c 与对照组比较P ＞0.05。a Compared with the control group，P＜0.01;b Compared with the model group，P＜0.01;cCompared with the control group，P ＞0.05.

2.2 免疫组织化学测得下丘脑OBR 的表达

各组小鼠下丘脑OBR 表达水平比较有差异(F=170.51，P＜0.01)，模型组表达水平较对照组显著降低(t=5.55，P＜0.01)，治疗组较模型组显著升高(t=18.03，P＜0.01)，治疗组较对照组亦有显著性升高(t=12.48，P＜0.01)。见图1，表2。

图1 对照组(A)、模型组(B)及治疗组(C)下丘脑OBR 免疫组化染色IH×400Fig.1 OBR expression in hypothalamus of control group (A)，model group (B)and treatment group (C)，immunohistochemical study IH×400

2.3 Western bloting 和RT-PCR 测得下丘脑OBR相

对照组、模型组和治疗组小鼠下丘脑OBR 表达水平比较有显著性差异(FWB=10.36，FPCR=15.46，P＜0.01)，模型组表达水平较对照组显著降低(tWB=2.14，tPCR=2.74，P＜0.05)，治疗组较模型组显著升高(tWB=4.59，tPCR=5.42，P＜0.01)，治疗组较对照组亦有显著性升高(tWB=2.56，tPCR=2.90，P＜0.05)。见图2，表2。

图2 各组下丘脑OBR 相对丰度的比较(左为WB，右为PCR)Fig.2 OBR relative expression of different groups (left for WB，right for PCR)

表2 各组小鼠免疫组化、PCR 及WB 测得OBR 相对丰度(，nIHC=5，nWB=7，nPCR=8)Table 2 Immunohistochemistry，PCR and WB measured OBR relative expression of different groups

表2 各组小鼠免疫组化、PCR 及WB 测得OBR 相对丰度(，nIHC=5，nWB=7，nPCR=8)Table 2 Immunohistochemistry，PCR and WB measured OBR relative expression of different groups

a与对照组比较，P＜0.05;b 与模型组比较，P＜0.01;c 与对照组比较P＜0.05。aCompared with the control group，P＜0.05;b Compared with the model group，P＜0.01;cCompared with the control group，P＜0.05.

3 讨论

高脂血症是指人体脂质代谢障碍导致的血浆胆固醇、甘油三酯水平的升高，与动脉粥样硬化关系密切。高血脂可引起机体氧化与抗氧化状态的失衡，氧自由基产生增加，增强脂质过氧化并破坏内皮细胞结构，促进粥样斑块的形成［7，8］。临床资料显示，高脂血症患者往往伴有血清瘦素水平的升高［2，9］，提示高脂血症患者可能存在瘦素抵抗。瘦素受体主要包含短型OBRa 和长型OBRb，存在于大脑脉络丛和血脑屏障微血管丛的OBRa 可以调节瘦素通过血脑屏障，OBRb 主要存在于下丘脑表达神经肽Y(NPY)的细胞表面，具有信号转导作用，是执行瘦素功能的主要受体［10］。瘦素抵抗主要涉及两种机制:中枢性瘦素抵抗(central leptin resistance)和外周性瘦素抵抗(peripheral leptin resistance)，主要发生在3个环节:瘦素通过血脑屏障向脑内转运障碍(外周性抵抗)，瘦素受体突变(OB-Rb 突变引起中枢性抵抗，OB-Ra 等短型受体突变引起外周性抵抗)，受体后信号转导异常(中枢性抵抗)［11］。有实验也表明增加外周瘦素或OB-Ra 短型受体含量有助于改善瘦素抵抗［12，13］。

本研究表明，高脂血症小鼠血清Leptin 水平代偿性升高，且未能使血脂恢复正常水平，说明存在瘦素抵抗，高水平的瘦素刺激下丘脑OBR，导致下丘脑OBR 下调，进一步加剧瘦素抵抗。应用海带多糖干预后，高脂血脂小鼠的Leptin 水平下降，下丘脑OBR 的水平升高，明显改善了瘦素抵抗，并使血脂恢复至正常水平。其可能机制为:海带多糖通过提高中枢OBR 的水平，一方面促进中枢OBRa 介导的血清Leptin 向脑脊液转移，另一方面下丘脑OBRb与Leptin 的结合量升高，明显改善瘦素抵抗，极大发挥了Leptin 的生物学作用:降低脂肪的摄入，抑制脂肪的合成，增加脂质的消耗［14］，从而使血脂水平恢复正常。另外海带多糖也可能有直接降血脂作用或通过其他途径改善血脂水平，故而关于海带多糖的降血脂作用机制有待于进一步研究。

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