蜗牛多肽混合物对过氧化氢诱导的SH-SY5Y 细胞PCNA 表达的影响

席守民，安君岭，赵焕东，温新丽，高永忠

1河南科技大学医学院药理学与医学分子生物学重点实验室，洛阳 471003;2 永城市中心医院，永城 476600

氧自由基对脑神经细胞的氧化修饰作用是导致神经元损伤的主要途径之一，在帕金森病和阿尔茨海默病的发生发展过程中具有重要的地位［1］。H2O2是一种比较常用的细胞氧化诱导剂，广泛用于诱导细胞氧化应激模型。有研究认为阿尔茨海默病与神经细胞凋亡有关，而细胞凋亡与氧自由基密切相关［2］。增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)在细胞增殖过程中起重要作用，是评价细胞增殖状态的重要指标［3］。蜗牛提取物中的某些成分具有增强细胞活力、促进组织细胞修复和再生的作用［4］。为了探讨蜗牛多肽混合物(snail polypeptide mixture，SPM)对神经元细胞的保护作用，本文用H2O2造成人神经母细胞瘤细胞株(SHSY5Y)细胞氧化损伤模型，观察SPM 对SH-SY5Y细胞的抗凋亡效果，为SPM 神经保护作用的深入研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)购自中国科学院上海细胞生物学研究所;白玉蜗牛，洛阳绿尔农业科技有限公司惠赠;小牛血清、DMEM 购自美国Gibco BRL 公司;Hoechst 染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;兔抗人单抗PCNA:武汉博士德生物工程有限公司生产;SP 免疫组化试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司;DAB 显色试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。

1.2 蜗牛多肽混合物的制备

参照文献［5］中的方法，取新鲜白玉蜗牛200 g，剁成小块;将蜗牛组织加到500 mL 预冷的pH 3.5的冰醋酸溶液，胶体磨反复匀浆;匀浆液4 ℃，5500 rpm 离心10 min，取上清;55 ℃真空旋转蒸发浓缩至体积为100 mL;浓缩液冻干，交联葡聚糖凝胶G-25分离层析，得到4个峰，分别收集，MTT 法体外活性实验检测第2 峰值活性最强。收集第2 峰样品，浓缩冻干，BCA 法测定样品中蛋白质含量为84.81%，氧化酶法测定样品中葡萄糖含量仅为0.24%，即为蜗牛多肽混合物，-20 ℃保存备用。

1.3 细胞培养及药物处理

SH-SY5Y 用含2 mmol/L 谷氨酰胺和10%小牛血清的DMEM 培养基，在37 ℃5% CO2培养箱中培养。隔天传代细胞，当传代细胞在倒置显微镜下观察均匀贴壁生长时，可用于实验研究。

1.4 MTT 法检测H2O2对SH-SY5Y 细胞的损伤作用

将生长状态良好的SH-SY5Y 细胞以1 ×104细胞/孔接种于96 孔板，待细胞贴壁。细胞贴壁后弃去培养液，每孔加含不同浓度(0.25～6.0)mmol/L H2O2的培养液200 μL，阴性对照组加不含H2O2的培养液200 μL，继续培养24 h 后每孔加入5 g/L MTT 溶液20 μL，继续培养4 h 后弃去培养液，每孔加入200 μL 二甲基亚砜(DMSO)，震荡5 min 后酶标仪490 nm 处检测每孔的吸光度(A)值。细胞存活率=给药组A 值/阴性对照组A 值×100%。Orgin 软件计算半数抑制浓度IC50。

1.5 MTT 法测定SPM 对H2O2诱导SH-SY5Y 细胞损伤的抑制作用

取对数生长期的SH-SY5Y 细胞，以1 ×104细胞/孔接种于96 孔板，待细胞贴壁。细胞贴壁后模型组以1.54 mmol/L H2O2作用于SH-SY5Y 细胞。治疗组分别以不同浓度(39～1250)mg/L SPM 和1.54 mmol/L H2O2作用于SH-SY5Y 细胞。对照组只加SH-SY5Y 细胞，不加药物。细胞给药24 h 后每孔加20 μL 浓度为5 g/L 的MTT 溶液。继续培养4 h 后弃去培养液，每孔加入200 μL DMSO，震荡5 min 后酶标仪490 nm 处检测A 值。

1.6 Hoechst 染色检测细胞凋亡

Hoechst 33342 可与凋亡细胞凝集的染色质结合，使其发出强蓝色荧光，从而与正常细胞加以区别［6］。将SH-SY5Y 细胞接种于24 孔板，培养24 h后，分4 组，H2O2组:加1.54 mmol/L H2O2;对照组:正常细胞培养，不加药物;SPM-L 组:加蜗牛多肽混合物39 mg/L 和1.54 mmol/L H2O2;SPM-H 组:加蜗牛多肽混合物156 mg/L 和1.54 mmol/L H2O2。再培养24 h 后，用PBS 洗3 次，加入新鲜配制的4%多聚甲醛固定细胞10 min，PBS 洗后用浓度为10 mg/L 的Hoechst 33342 染液作用于细胞，避光孵育15 min，PBS 小心冲洗后荧光显微镜下观察摄片。每孔随机数200个细胞，计算凋亡细胞百分比。

1.7 细胞免疫化学技术检测细胞PCNA 的表达

取对数生长期SH-SY5Y 细胞消化制备细胞悬液，调整细胞浓度为l×104个/mL，接种于内置无菌玻片的6 孔板内。培养24 h 后，分4 组(同1.6 分组)，以上各组平行3 孔，继续培养48 h 后，爬片用PBS 漂洗2 遍，经4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗涤后自然风干。检测方法按免疫组化试剂盒说明书进行。

1.8 Western blot 检测细胞PCNA 的表达

取对数生长期SH-SY5Y 细胞，接种于内置无菌玻片的6 孔板内。培养24 h 后，分4 组，加入不同药物处理(同1.6 分组)。以上各组平行3 孔，继续培养48 h 后，每孔分别加入120 μL 蛋白裂解液裂解后，在冰浴下静置裂解30 min，95 ℃加热5 min后，取25 μL 品进行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后取出凝胶，于4 ℃下60 mA 电流转印过夜至硝酸纤维素膜，脱脂奶粉封闭1 h 后，分别加入1∶1000 稀释的PCNA 单抗4 ℃过夜，洗膜后用1∶2000 稀释的二抗-辣根过氧化酶(HRP)交联物孵育2 h，按照Super Signal west pico chemiluminescent substrate 试剂盒(PIERCE 公司，美国)说明，加入显色剂后，X 光片于室温下自显影20 s，使用凝胶分析系统摄像并分析。

1.9 统计学处理

2 实验

2.1 H2O2对SH-SY5Y 细胞存活率的影响

MTT 法检测分析显示，(0.25～6.0)mmol/L 不同浓度的H2O2处理SH-SY5Y 细胞24 h 后，该细胞的存活率呈浓度依赖性降低。通过Orgin 软件计算可知，H2O2对SH-SY5Y 细胞IC50为1.54 mmol/L，见图1。

图1 MTT 法检测不同浓度的H2O2处理后的SH-SY5Y细胞存活率Fig.1 Viability of SH-SY5Y cells in different concentrations of H2O2

2.2 MTT 法测定SPM 抗H2O2诱导SH-SY5Y 细胞毒性

图2 显示采用MTT 法检测H2O2及SPM 处理后的SH-SY5Y 细胞存活率结果。A 组(H2O2组)显示，加入1.54 mmol/L H2O2作用24 h 后，SH-SY5Y细胞存活率仅为(47.65 ±3.52)%，而同时加入不同浓度的蜗牛多肽的治疗组的细胞生长力明显较A组好。B 和C 组与A 组比较差异有显著性意义(tB=-7.41，PB=0.018，tC=-7.85，PC=0.016)，D～G组分别与A 组比较差异有显著性意义(tD=-21.30，PD=0.002，tE=-186.20，PE=0.000，tF=-54.54，PF=0.000，tG=-42.65，PG=0.001)，但B 组与C组比较以及D～G 组之间比较均无明显差异性。提示低剂量39 mg/L(SPM-L)和高剂量156 mg/L(SPM-H)蜗牛多肽均可显著降低H2O2引起SHSY5Y 细胞毒性。

图2 MTT 法检测H2O2及SPM 处理后的SH-SY5Y 细胞存活率Fig.2 Viability of SH-SY5Y cells in seven groups

2.3 Hoechst 染色检测细胞凋亡结果

Hoechst33342 染色结果显示，正常对照组细胞核呈弥漫均匀的低强度荧光，凋亡率仅为3.5%;1.54 mmol/L H2O2处理SH-SY5Y 细胞24 h 后，SHSY5Y 细胞呈现明显的凋亡特征，如细胞质浓缩、细胞核碎裂等，凋亡率高达(58.39 ±8.67)%;SPM-L(1.54 mmol/L H2O2+39 mg/L SPM)组和SPM-H(1.54 mmol/L H2O2+156 mg/L SPM)凋亡率分别为(44.06 ± 4.35)% 和(32.45 ± 9.44)%，提示SPM-H 能使H2O2引起的具有凋亡特征的细胞数目明显减少，与H2O2组比较差异有显著性意义(t=4.312，P=0.013)，见图3。

图3 Hoechst 染色观察3 组间SH-SY5Y 细胞凋亡的结果(×200)Fig.3 The results of SH-SY5Y cell apoptosis of three groups by Hoechst staining (×200)

2.4 SH-SY5Y 细胞PCNA 的表达结果

PCNA 表达于细胞核中，染色阳性信号呈棕黄色。与正常对照组相比，H2O2组SH-SY5Y 细胞PCNA 的表达明显减少;SPM-L 组和SPM-H 组PCNA表达显色则较H2O2组明显增强，呈强阳性染色，且阳性细胞数明显增加。见图4。

2.5 Western blot 检测SH-SY5Y 细胞PCNA 的表达结果

由图5 可见，H2O2组SH-SY5Y 细胞PCNA 的表达明显较正常对照组减少;而SPM-L 组和SPM-H 组细胞中PCNA 表达均较H2O2组明显升高，即呈剂量依赖性，与H2O2组比较差异有显著性意义(P＜0.05)。

3 讨论

图4 免疫组化检测PCNA 在4 组SH-SY5Y 细胞中的表达(×200)Fig.4 The expression of PCNA in the SH-SY5Y cell of four groups by immunochemistry (×200)

图5 4 组SH-SY5Y 细胞中PCNA 蛋白质的表达结果Fig.5 Expression of PCNA in SH-SY5Y cells of four groups

脑神经元损伤的机制包括自由基损伤、细胞内钙离子超载和炎症反应等。脑神经元损伤是由自由基损伤环节触发，钙离子超载为中间环节，炎症反应为最终通路的级联反应。氧化应激诱发的自由基损伤是导致神经元凋亡的基本原因之一，因此抗氧化是保护神经元的有效途径。H2O2是氧化应激反应密切相关的活性氧之一，其主要产物具有很强的氧化性并可自由进入细胞，在许多神经元细胞培养模型中可引起细胞损伤，且许多中枢神经系统疾病都涉及到氧化应激损伤［7］。研究证明，用1.54 mmol/L H2O2处理SH-SY5Y 细胞，可以引起细胞存活率降低，细胞凋亡等改变。

增殖细胞核抗原PCNA 是DNA 聚合酶δ 的辅助蛋白，参与调节DNA 的合成，与细胞的增殖周期密切相关。PCNA 是伴随细胞增殖而表达的一种核内蛋白，可作为一项评估细胞增殖状态的指标。Savio 等［8］对静止的纤维母细胞应用甲磺酸甲酯和H2O2处理后，发现与细胞核结合的PCNA 呈剂量依赖性增加，说明在静止期细胞PCNA 同样参与了受损DNA 的碱基修复过程［9］;通过将1 周龄的小鼠海马脑片进行培养，并接受紫外线照射损伤后，发现能诱导CA3 区锥体细胞PCNA 表达增高，说明在神经系统中非增生细胞PCNA 的表达与DNA 的损伤修复有关;研究发现，用1.54 mmol/L H2O2处理SHSY5Y 细胞，细胞凋亡调控因子PCNA 的表达较正常对照组明显减少，而SPM 处理后的SH-SY5Y 细胞PCNA 明显增加，我们认为SPM 可能是通过改善DNA 的修复和细胞凋亡，增加细胞核PCNA 表达，从而抑制SH-SY5Y 细胞氧化损伤，起到抗氧化作用。

《本草纲目》中记载，蜗牛具有调节机体功能、促进人体新陈代谢、增强细胞活力及提高机体免疫力，对糖尿病、高血压、高血脂、恶疮和癌症等疾病有辅助治疗作用。研究发现，蜗牛提取物通过干扰病毒吸附和穿入宿主细胞等机制明显抑制HBV 复制的作用，且无细胞毒性［10］。Tsoutsos D 等［4］采用蜗牛提取物用于治疗开放性创伤和面部深度烫伤，发现蜗牛提取物可以促进开放性创伤和深度烫伤的皮肤愈合，提示蜗牛提取物中某些成分可促进组织细胞修复和再生。研究发现，无论是低剂量还是高剂量的SPM 均具有抗氧化作用，在(39～156)mg/L 范围内呈浓度依赖性的抑制H2O2引起的细胞毒性作用，并且可明显提高细胞的存活率，显著降低H2O2诱导的细胞凋亡，提示SPM 具有神经细胞保护作用，能对抗H2O2引起的细胞凋亡。

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2 Takasaki Y，Kaneda K，Takeuchi K，et al.Analysis of the structure of proteasome-proliferating cell nuclear antigen(PCNA)multiprotein complex and its autoimmune response in lupus patients.Annals New York Acade Sci，2003，987:316-318.

3 Kononen J，Bubendorf L，Kallioniemi A，et al.Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.Nat Med，1998，4:844-847.

4 Tsoutsos D，Kakagia D，Tamparopoulos K.The efficacy of Helix aspersa Müller extract in the healing of partial thickness burns:a novel treatment for open burn management protocols.J Dermatol Treat，2009，20:219-222.

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7 Zhang XJ，Chen HL，Li Z，et al.Analgesic effect ofpaeoniflorin in rats with neonatal maternal separation-induced visceral hyperalgesiais mediated through adenosine A(1)receptorby inhibiting the extracellular signal-regulated protein kinase(ERK)pathway.Pharmocal Biochem Behav，2009，94:88-97.

8 Savio M，Stivala LA，Bianchi L，et al.Involvement of the proliferating cell nuclear antigen (PCNA)in DNA repair induced by alkylating agents and oxidative damage in human fibroblasts.Carcinogenesis，1998，19:591-596.

9 Ino H，Chiba T.Expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA)in the adult and developing mouse nervous system.Brain Res Mol Brain Res，2000，78:163-174.

10 Wang KX(王克霞)，Zhan XD(湛孝东)，Li CP(李朝品)，et al.Effect of bradybaena kiangsiensis-polysaccharide on duplication of HBV in 2.2.15 cell strain.Chin Pharmacol Bull (中国药理学通报)，2006，22:378-379.