三角帆蚌多糖的微波辅助提取及脱蛋白工艺

乔德亮，孙传伯，何晓梅，韦传宝，朱旺生，2

1皖西学院生物与制药工程学院;2 皖西学院农业工程设计与技术服务中心，六安 237012

多糖乃生物体内重要的生理活性物质之一。多糖提取时采用常规的“水提醇沉”法，所需提取温度较高、提取时间较长，而且提取得率也较低。微波辅助提取可以提高多糖的提取得率，此法是高效提取多糖的技术措施之一，已被广泛应用于多糖的提取中［1，2］。多糖提取过程中一般需要进行脱蛋白处理，脱蛋白的方法主要有Sevag 法、三氯乙酸法以及蛋白酶法等，Sevag 法因其具有反应条件温和、几乎不破坏多糖结构等优点而被广泛采用［3，4］。

三角帆蚌(Hyriopsis cumingii Lea)俗称三角蚌、珍珠蚌等，为我国特有的淡水贝类，也是我国最主要的珍珠养殖母蚌之一，其养殖业已分布浙江、安徽、湖北、湖南、江苏、江西、福建等多个省份。三角帆蚌目前主要用于培育珍珠，但其软体组织还富含蛋白类、多糖类物质等营养成分，具有多种重要用途。已有研究显示，三角帆蚌多糖具有增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤等作用［5-7］，但三角帆蚌多糖的微波辅助提取及脱蛋白工艺未见报道。本文利用微波辅助提取技术和Sevag 法脱蛋白技术，在单因素实验基础上，通过正交实验对三角帆蚌多糖的提取参数和蛋白脱除参数进行优化，为三角帆蚌多糖的进一步研究和开发利用积累一些资料。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

三角帆蚌购于安徽省无为县珍珠养殖场，洗净取其内脏组织用乙醇(体积分数为75%)浸泡备用。

微波消解仪(WMX-Ⅲ-A 型，广东韶关科力实验仪器有限公司);数显恒温水浴锅(HH-4 型，常州国华电器有限公司);紫外可见分光光度计(Alpha-1500 型，上海谱元仪器有限公司);气浴恒温振荡器(CHA-SA 型，金坛市杰瑞尔电器有限公司)等。

葡萄糖标准品购于Sigma 公司，其它试剂均为常规分析纯试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 多糖的微波辅助提取

参照Zhong 等［1］、黎庆涛等［2］报道的方法稍作修改。取保存备用的材料加适量去离子水进行微波处理(水料比5～20 mL/g，微波时间30～150 s，微波功率270～1350 W)，然后再用20～80 ℃热水浸提2 h。将浸提液离心(5000 rpm，15 min)取上清液，沉淀物用相同方法再提取2 次，离心(5000 rpm，15 min)取上清液。合并3 次上清液，置旋转蒸发器50 ℃减压浓缩至适量，浓缩液加3 倍体积无水乙醇(乙醇终浓度为75 %)沉淀过夜，离心(5000 rpm，15 min)取沉淀物，得到水溶性粗提物。粗提物采用Sevag 法脱除游离蛋白，得粗多糖。粗多糖中多糖含量的测定参照张惟杰［8］报道的苯酚-硫酸比色法稍作修改，以葡萄糖标准品为标样制作标准曲线。

在单因素实验(水料比、提取温度、微波时间、微波功率)基础上进行正交实验，每组设3个平行，因素水平的确定以多糖提取得率为判断指标。

1.2.2 多糖粗提物中蛋白质的Sevag 法脱除

参照朱劼等［3］报道的方法经适当修改。取多糖粗提物溶液(约1.0 mg/mL)50 mL，加入一定体积的氯仿-正丁醇混合液(混合液中正丁醇与氯仿体积比例0.15～0.35、混合液用量占多糖溶液的体积百分比15%～35%)，摇床剧烈振荡10～50 min，分液漏斗静置30 min 使其分层，去除下层有机溶剂-蛋白相。上清液用相同方法反复脱蛋白6～10 次。将上清液定容至50 mL，测量多糖溶液的蛋白质去除率和多糖保留率。

蛋白去除率的测定采用紫外吸收法，即利用蛋白质在280 nm 处有强吸收的特点，测量多糖溶液的280 nm 吸光值。多糖保留率的测定运用苯酚-硫酸比色法［8］，测量反应体系的490 nm 吸光值。然后比较脱蛋白前后的吸光值，计算出蛋白去除率和多糖保留率。

在单因素实验(正丁醇与氯仿比例、混合液用量、脱蛋白时间、脱蛋白次数)基础上进行正交实验，每组设3个平行，因素水平的确定以蛋白去除率、多糖保留率为判断指标。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验对微波辅助提取三角帆蚌多糖提取得率的影响

2.1.1 水料比对三角帆蚌多糖提取得率的影响

水料比设置5、10、15 和20 mL/g 四个梯度，提取温度、微波时间及微波功率分别是65 ℃、120 s 和1080 W，此时水料比对三角帆蚌多糖得率的影响见如图1(A)所示。当水料比在5～15 mL/g 范围内，随着水料比的增加，多糖得率显著增加(P＜0.05);15～20 mL/g 范围内，水料比增加多糖得率差异不显著(P ＞0.05)。张民等［9］报道水体积的增加有利于多糖物质的溶出和运输，从而可以提高多糖的提取得率，但超过一定比例后影响并不显著。本研究结果与此类似。当水料比小于15 mL/g 时，水料比对三角帆蚌多糖得率的影响呈正向显著性;当水料比大于15 mL/g 时，水料比对三角帆蚌多糖得率的影响不显著。考虑到加水过多不利于后期的浓缩，所以15 mL/g 被选作后续正交实验水料比的中心点。

2.1.2 提取温度对三角帆蚌多糖提取得率的影响

提取温度设置20、35、50、65 和80 ℃五个梯度，水料比、微波时间及微波功率分别为15 mL/g、120 s和1080 W，此时提取温度对三角帆蚌多糖得率的影响见图1(B)。当提取温度在20～50 ℃范围内，随着温度的升高，多糖得率显著增加(P＜0.05);50～80 ℃范围内，温度升高多糖得率差异不显著(P ＞0.05)。有研究报道，温度升高可增加多糖的扩散系数和溶解性，有利于多糖从材料中进入提取溶剂内，从而可提高多糖的提取得率［10］。但温度升高一定以后，多糖进出材料已接近平衡，多糖的提取得率达到最大值。继续增加温度，可能引起多糖链的水解，提取得率反而下降［11］。本研究结果，当温度小于50 ℃时，提取温度对三角帆蚌多糖得率的影响呈正向显著性;当温度大于50 ℃时，提取温度对三角帆蚌多糖得率的影响不显著。所以为了节约能源和成本，50 ℃被选作后续正交实验提取温度的中心点。

2.1.3 微波时间对三角帆蚌多糖提取得率的影响

研究显示，一定范围内提取时间与多糖得率呈正相关，即时间的延长可提高多糖的得率［12］。但时间过长，可能引起多糖结构的改变，导致多糖得率减少［13］。本研究微波时间设置30、60、90、120 和150 s 五个梯度，水料比、提取温度及超声功率数分别是15 mL/g、65 ℃和1080 W，此时微波时间对三角帆蚌多糖得率的影响如图1(C)所示。微波时间在30～120 s 范围内，随着时间的延长，多糖得率呈逐渐增加趋势;120～150 s 范围内，时间延长多糖得率呈下降趋势。所以，120 s 被选作后续正交实验微波时间的中心点。

2.1.4 微波功率对三角帆蚌多糖提取得率的影响

微波功率设置270、540、810、1080 和1350 W 五个梯度，水料比、提取温度及微波时间分别是15 mL/g、65 ℃和120 s，此时微波功率对三角帆蚌多糖得率的影响见图1(D)。当微波功率在270～1080 W 范围内，随着功率的增加，多糖提取得率呈逐渐增加趋势;1080～1350 W 范围内，功率的增加多糖得率呈下降趋势。所以，1080 W 被选作后续正交实验微波功率的中心点。

图1 水料比(A)、温度(B)、微波时间(C)及微波功率(D)对三角帆蚌多糖提取得率的影响Fig.1 Effect of ratio of water to raw material (A)，extraction temperature (B)，microwave duration (C)and microwave power (D)on the yield of H.cumingii polysaccharides

2.2 正交实验优化三角帆蚌多糖的提取参数

在单因素实验的基础上，进行4 因素3 水平的正交实验，以多糖提取得率为指标，对三角帆蚌多糖的微波辅助提取条件进行优化。正交实验设计及结果列于表1。由表中极差值大小可知，提取温度对三角帆蚌多糖的提取得率影响最大，其次分别为微波时间、水料比和微波功率，即各因素影响的大小顺序为B ＞C ＞A ＞D。从表中均值大小可以看出，提取条件的最佳组合为A2B2C3D2。

取3 份三角帆蚌样品，以最佳条件组合(A2B2C3D2)进行多糖微波辅助提取的验证实验，结果多糖的提取得率为4.06%，略高于表中最优组合(A2B2C3D1)的实验结果(3.99%)。正交实验结果的方差分析列于表2。由表2 可知，四个因素(水料比、提取温度、微波时间、微波功率)对多糖提取得率的影响都是显著的。所以，最终确定三角帆蚌多糖微波辅助提取条件的最优组合为A2B2C3D2，即水料比15 mL/g、提取温度50 ℃、微波时间150 s、微波功率1080 W。

表1 三角帆蚌多糖微波辅助提取的正交实验设计及结果(n=3，)Table 1 Design matrix and results of orthogonal experiment for the microwave-assisted extraction of H.cumingii polysaccharides (n=3，)

表1 三角帆蚌多糖微波辅助提取的正交实验设计及结果(n=3，)Table 1 Design matrix and results of orthogonal experiment for the microwave-assisted extraction of H.cumingii polysaccharides (n=3，)

表2 三角帆蚌多糖微波辅助提取正交实验结果的方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiment results for the microwave-assisted extraction of H.cumingii polysaccharides

2.3 三角帆蚌多糖Sevag 法脱蛋白单因素实验结果

2.3.1 正丁醇与氯仿比例对三角帆蚌多糖蛋白去除率、多糖保留率的影响

正丁醇与氯仿体积比设置0.15、0.20、0.25、0.30 和0.35 五个梯度，混合液用量、脱蛋白时间及脱蛋白次数分别是30%、40 min 和8 次，此时正丁醇与氯仿比例对三角帆蚌多糖蛋白去除率、多糖保留率的影响如图2(A)所示。正丁醇与氯仿比例为0.35 时，蛋白去除率最高，但多糖损失严重，多糖保留率很低;正丁醇与氯仿比例为0.20 时，蛋白去除率和多糖保留率均较高。所以，0.20 被选作后续正交实验正丁醇与氯仿比例的中心点。

2.3.2 混合液用量对三角帆蚌多糖蛋白去除率、多糖保留率的影响

正丁醇-氯仿混合液用量占多糖溶液的体积百分比设置15%、20%、25%、30%和35%五个梯度，正丁醇与氯仿比例、脱蛋白时间及脱蛋白次数分别是0.25、40 min 和8 次，此时混合液用量对三角帆蚌多糖蛋白去除率、多糖保留率的影响如图2(B)所示。混合液用量为30%时，蛋白去除率最高，但多糖损失严重，多糖保留率低;混合液用量为35%时，多糖保留率最高，但蛋白质保留的也多，蛋白去除率低;混合液用量为15%时，蛋白去除率、多糖保留率均较高。所以，15%被选作后续正交实验混合液用量的中心点。

图2 正丁醇与氯仿比例(A)、混合液用量(B)、脱蛋白时间(C)、脱蛋白次数(D)对三角帆蚌多糖蛋白去除率和多糖保留率的影响Fig.2 Effect of ratio of n-butyl alcohol to chloroform (A)，dosage of mixture (B)，deproteinization duration (C)and times of deproteinization (D)on the protein removal percentage and polysaccharide remaining percentage of H.cumingii polysaccharides

2.3.3 脱蛋白时间对三角帆蚌多糖蛋白去除率、多糖保留率的影响

脱蛋白时间设置10、20、30、40 和50 min 五个梯度，正丁醇与氯仿比例、混合液用量及脱蛋白次数分别是0.25、30%和8 次，此时脱蛋白时间对三角帆蚌多糖蛋白去除率、多糖保留率的影响如图2(C)所示。脱蛋白时间为10 min 时，蛋白去除率最高，但多糖保留率也是最低;脱蛋白时间为20 min 时，蛋白去除率、多糖保留率均较高。所以，20 min 被选作后续正交实验脱蛋白时间的中心点。

2.3.4 脱蛋白次数对三角帆蚌多糖蛋白去除率、多糖保留率的影响

脱蛋白次数设置6、7、8、9 和10 次五个梯度，正丁醇与氯仿比例、混合液用量及脱蛋白时间分别是0.25、30%和40 min，此时脱蛋白次数对三角帆蚌多糖蛋白去除率、多糖保留率的影响如图2(D)所示。脱蛋白次数在6～10 次范围内，随着次数的增加，蛋白去除率呈逐渐增加趋势、多糖保留率呈逐渐减少趋势。脱蛋白次数为9 次时，蛋白去除率、多糖保留率均较高。所以，9 次被选作后续正交实验脱蛋白次数的中心点。

2.4 正交实验优化三角帆蚌多糖的脱蛋白参数

根据单因素实验结果，进行4 因素3 水平的正交实验，以蛋白去除率、多糖保留率为指标，对三角帆蚌多糖的Sevag 法脱蛋白条件进行优化。正交实验设计及结果列于表3。由表中极差值大小可知:影响蛋白去除率的主要因素为正丁醇与氯仿比例，其次是脱蛋白次数、混合液用量和脱蛋白时间;影响多糖保留率的主要因素为脱蛋白次数，其次是正丁醇与氯仿比例、混合液用量和脱蛋白时间。

表3 三角帆蚌多糖脱蛋白的正交实验设计及结果(n=3，)Table 3 Design matrix and results of orthogonal experiment for the deproteinization of H.cumingii polysaccharides (n=3，)

表3 三角帆蚌多糖脱蛋白的正交实验设计及结果(n=3，)Table 3 Design matrix and results of orthogonal experiment for the deproteinization of H.cumingii polysaccharides (n=3，)

有研究报道，Sevag 法脱蛋白时重复处理，随着蛋白去除率的逐渐增加，多糖保留率会逐渐下降。分析可能原因:Sevag 试剂处理形成的凝胶物中夹带有多糖物质;有些多糖与蛋白结合形成的糖蛋白也会发生凝聚沉淀。这样导致多糖保留率的下降［14］。本研究结果显示与此类似。从表3 中均值大小可以看出，蛋白去除率的最佳组合为A2B2C3D3，多糖保留率的最佳组合为A3B1C1D1。对蛋白去除率和多糖保留率进行综合分析:A 因素取水平1 时，得到中等的蛋白去除率、低等的多糖保留率;取水平2 时，得到高等的蛋白去除率、中等的多糖保留率;取水平3 时，得到低等的蛋白去除率、高等的多糖保留率;所以因素A 取水平2 最适宜。B 因素取水平1 时，得到低等的蛋白去除率、高等的多糖保留率;取水平2 时，得到高等的蛋白去除率、低等的多糖保留率;取水平3 时，得到中等的蛋白去除率、中等的多糖保留率;所以因素B 取水平3 最适宜。C 因素取水平1 时，得到中等的蛋白去除率、高等的多糖保留率;取水平2 时，得到低等的蛋白去除率、中等的多糖保留率;取水平3 时，得到高等的蛋白去除率、低等的多糖保留率;所以因素C 取水平1 最适宜。D 因素取水平1 时，得到中等的蛋白去除率、高等的多糖保留率;取水平2 时，得到低等的蛋白去除率、中等的多糖保留率;取水平3 时，得到高等的蛋白去除率、低等的多糖保留率;所以因素D 取水平1 最适宜。这样，综合考虑蛋白去除率和多糖保留率，确定A2B3C1D1为最佳脱蛋白工艺条件。

正交实验结果的方差分析列于表4。由表4 可知，四个因素(正丁醇与氯仿比例、混合液用量、脱蛋白时间、脱蛋白次数)对蛋白去除率、多糖保留率的影响都是显著的。所以，确定三角帆蚌多糖Sevag法脱蛋白条件的最优组合为A2B3C1D1，即正丁醇与氯仿比例为0.20，混合液用量为20%，脱蛋白时间为10 min，脱蛋白次数为8 次。取3 份三角帆蚌多糖粗提物溶液，以最优条件组合(A2B3C1D1)进行Sevag 法脱蛋白的验证实验，结果多糖的蛋白去除率为52.24%、多糖保留率为65.13%。

表4 三角帆蚌多糖脱蛋白正交实验结果的方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment results for the deproteinization of H.cumingii polysaccharides

3 结论

通过正交实验优化了微波辅助提取三角帆蚌多糖的工艺条件，最优参数组合为:水料比15 mL/g、提取温度50 ℃、微波处理时间150 s、微波功率1080 W。在此条件下，三角帆蚌多糖的提取得率为4.06%。同时也优化了三角帆蚌多糖Sevag 法脱蛋白的工艺参数，最优脱蛋白条件为:正丁醇与氯仿体积比0.20、正丁醇-氯仿混合液用量占多糖溶液的体积百分比20%、脱蛋白振摇时间10 min、脱蛋白次数8 次。在此条件下，三角帆蚌多糖的蛋白去除率为52.24%、多糖保留率为65.13%。

1 Zhong K，Lin WJ，Wang Q，et al.Extraction and radicals scavenging activity of polysaccharides with microwave extraction from mung bean hulls.Int J Biol Macromol，2012，51:612-617.

2 Li QT(黎庆涛)，Pan LL(潘路路)，Huang KN(黄康宁)，et al.Microwave-assisted extraction of polysaccharide from Sargassum thunbergii.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2011，23:1160-1162.

3 Zhu J(朱劼)，Ren SZ(任淑振)，Peng JC(彭江晨).Optimization of polysaccharide extraction from Spirulina platensis by cell freeze-thaw cooperated with hot water extraction and deproteinization.Food Sci(食品科学)，2012，33:111-116

4 Wang JP(王金鹏)，Chen HQ(陈寒青)，Deng L(邓力)，et al.Comparison of different methods for removal of protein from extracted polysaccharide of Acanthopanax senticosus.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2009，21:55-158.

5 Dai Z，Zhang H，Zhang Y，et al.Chemical properties and immunostimulatory activity of a water-soluble polysaccharide from the calm of Hyriopsis cumingii Lea.Carbohyd Polym，2009，77:365-369.

6 Qiao D，Ke C，Hu B，et al.Anti-oxidant activities of the polysaccharides from Hyriopsis cumingii.Carbohyd Polym，2009，78:199-204.

7 Qiao D，Luo J，Ke C，et al.Immunostimulatory activity of the polysaccharides from Hyriopsis cumingii.Int J Biol Macromol，2010，47:676-680.

8 Zhang WJ(张惟杰).Sugar Compound Biochemical Research Technology(糖复合物生化研究技术).Hangzhou:Zhejiang University Press，1999.11.

9 Zhang M(张民)，Qin PJ(秦培军)，Chen QJ(陈倩娟).Studies on extraction of polysaccharides in garlic and its molecular weight.Food Ferment Ind(食品与发酵工业)，2009，35:160-163.

10 Hou XJ，Zhang N，Xiong SY，et al.Extraction of BaChu mushroom polysaccharides and preparation of a compound beverage.Carbohyd Polym，2008，73:289-294.

11 Singh V，Malviya T.A non-ionic glucomannan from the seeds of an indigenous medicinal plant:Bryonia lacinosa.Carbohyd Polym，2006，64:481-483.

12 Liu ZD，Wei GH，Guo YC，et al.Image study of pectin extraction from orange skin assisted by microwave.Carbohyd Polym，2006，64:548-552.

13 Cai W，Gu X，Tang J.Extraction，purification，and characterization of the polysaccharides from Opuntia milpa alta.Carbohyd Polym，2008，71:403-410.

14 Qiao QQ(乔茜茜)，Qi Y(祁英)，Sun JZ(孙建忠)，et al.Extraction and protein removal of polysaccharides from hops.Sci Technol Food Ind(食品工业科技)，2012，33:251-256.