牡丹皮化学成分系统化色谱分离方法研究

朱靖博 ，韩聪敏，丁 燕，寇自农，王振中，萧 伟

1大连工业大学食品学院;2 大连工业大学分析测试中心，大连 116034;3江苏康缘药业股份有限公司，连云港 222001

中药现代化的核心是对中药成分的系统性认识，包括化学成分与药理活性的认识，其中化学成分认识的前提是对化学成分的系统性分离。中药成分具有种类繁多、共存多种结构类似物、化学稳定性差、理化性质跨度大等特点［1，2］。针对中药特点制定系统分离方法是实现中药现代化的关键，而色谱分离技术是实现中药成分系统分离的有效手段;植物提取物的色谱条件筛选及快速分离制备已有相关报导［3，4］。至今已从牡丹皮中发现了80 多种化学成分，包括丹皮酚类、芍药苷类、黄酮类、三萜类、甾体类等多种化合物［5］。鉴于中药成分的复杂性和色谱分离技术的特殊性，提高色谱分离效率、降低色谱柱污染，研究系统化色谱分离方法分离牡丹皮中的化学成分，形成具有指导意义的体系与程序对于中药现代化研究具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

牡丹皮药材由江苏康缘药业股份有限公司提供。分析级甲醇、正己烷、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、二氯甲烷、丙酮，天津大茂化学试剂厂;工业级甲醇、氯仿、丙酮，天津科密欧化学试剂有限公司;色谱级乙腈，美国Tedia 公司;超纯水，实验室自制。

高效液相色谱仪UltiMate3000，美国戴安公司;R502B 旋转蒸发仪、SHZ-D (Ⅲ)循环水式真空泵，巩义予华仪器责任有限公司;升降恒温水浴锅，英峪高科仪器厂;硅胶GF254板、薄层层析硅胶，青岛海洋化工有限公司;制备柱4 cm ×40 cm，实验室自制;P270 高压恒流泵，大连依利特公司。

图1 牡丹皮化学成分系统分离流程Fig.1 Systematic separation flow chart of chemical components from Moutan Cortex

1.2 实验方法

1.2.1 HPLC 分析条件

HPLC 条件:Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm);进样量20 μL，流速0.8 mL/min，检测波长254 nm，柱温为室温。流动相0.01% 甲酸-水(A)和乙腈(B)。线形梯度洗脱程序为:0～2 min，5% B;2～30 min，5%～16% B;30～70 min，16%～33% B;70～80 min，33%～80% B。

1.2.2 系统化色谱分离方法研究路线

总体思路:甲醇提取牡丹皮药材得到提取物，对提取物进行系统溶剂萃取评价;经TLC 和HPLC 分析选出适宜的前处理萃取溶剂。再对每个部位进行色谱分离条件筛选。选定其中一个部位，研究色谱分离条件的筛选方法，利用薄层色谱中Rf值与柱色谱洗脱速度之间的关系，进行多阶梯梯度分离预测;同时进行制备柱色谱分离验证预测结果。本文以牡丹皮正己烷相经真空液相层析后得到的Fr1.3 组分为例，论证色谱分离洗脱体系及洗脱强度筛选，确定组分的色谱分离条件的过程。总体路线如图1 所示。

1.2.3 药材提取

牡丹皮药材8.90 kg，粉碎过筛后甲醇加热回流提取(料液比1∶6)3 次，每次2 h，合并浓缩得到甲醇提取物。

1.2.4 系统溶剂萃取评价

分别称取4.0 g 牡丹皮甲醇提取物三份，加水至320 mL，用50%碳酸氢钠溶液调节pH 分别至4、7、9。按照图2 实验设计进行萃取评价，TLC、HPLC分析所得样品成分变化，确定色谱前处理的萃取溶剂。TLC 分析条件:有机相为V正己烷:V丙酮=7∶3，水相为V氯仿:V甲醇=8∶2，显色剂为5%香草醛浓硫酸。

图2 牡丹皮甲醇提取物系统溶剂萃取评价Fig.2 Evaluation of systematic solvent extraction of Moutan Cortex methanol extract

图3 正相色谱分离条件系统筛选Fig.3 Systemic screening of separation condition in normal phase chromatography

表1 TLC 展开溶剂系统筛选实验条件Table 1 Systemic screening of TLC solvent system

1.2.5 色谱分离条件研究

1.2.5.1 待分离组分准备

牡丹皮甲醇提取物经正己烷、乙酸乙酯依次萃取，得到正己烷相、乙酸乙酯相和水相三个组分。正己烷相样品(240 g)经硅胶真空液相柱层析V正己烷∶∶V丙酮=100∶0、90∶1、70∶1、50∶1、20∶1、1∶1 洗脱，合并各洗脱液，共得Fr1.1～Fr1.5 五个组分。

1.2.5.2 牡丹皮各部位色谱分离填料及流动相筛选

牡丹皮正己烷、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、水相部位、正己烷相部位的Fr 1.3 分别用硅胶板、聚酰胺板和中性Al2O3板进行薄层色谱分析，以斑点个数(N)、难分离物质对ΔRf为指标，考察三种填料的分离情况。实验设计见图3。

1.2.5.3 流动相洗脱比例筛选

在选定洗脱溶剂的基础上进行二元溶剂100∶0、99∶1、98∶2、97∶3 等的依次展开，同时对洗脱初始条件进行连续四次展开，Rf考察范围为0.10～0.70。

1.2.6 多阶梯梯度分离预测

图4 一阶梯度(A)、二阶梯度(B)洗脱色谱柱内溶质X、Y 预测分离图Fig.4 Predicted column chromatography charts of first step gradient (A)and second step gradient (B)of compound X and Y

依据色谱理论［6］，容量因子k 与TLC 中比移值Rf满足关系式k=1/Rf-1(1)，多阶梯梯度洗脱色谱中［7］，溶质在色谱柱内的移动速率满足Ux=U0/(1+k)(2)(其中U0、Ux为色谱柱内流动相流速、化合物X移动速度，图4)，由(1)、(2)可得Ux=U0·Rf(3)，则第一个台阶洗脱下化合物X 的保留时间tRx=L/Ux=L/(U0·Rfx)=t0/Rfx，保留体积VRx=tRx·U0;第二个台阶梯度时:在前一个台阶洗脱基础上，未洗脱化合物Y 的保留时间tRy=(L-tRx·Uy1)/Uy2;VR2=tRy·U0。Uy1、Uy2分别是Y 在色谱柱内第一、第二阶梯洗脱下的移动速度。选择正己烷相Fr

1.3 进行台阶梯度洗脱分离下保留值预测。

1.2.7 制备柱色谱分离

制备柱为4 ×40 cm，薄层硅胶干法装柱，初始溶剂90 mL/min 冲洗至柱压恒定，空柱体积V0=490 mL，洗脱流速25 mL/min，柱压2.2～2.4 MPa，柱硅胶235～240 g。上样量分别为0.55 g、1.55 g、3.95 g，参考上样量公式［4］为SiO2g=151.2Sg+0.5，SiO2g=59.8Sg，洗脱馏分1/5 柱体积(约100 mL)。

2 结果与讨论

2.1 药材提取与分析

牡丹皮药材8.90 kg 提取得到2.54 kg 浸膏，得率28.5%。液相色谱检测结果(图5)显示牡丹皮甲醇提取物成分复杂，对化合物的分离制备需借助萃取等前处理技术及系统色谱条件筛选来完成复杂化学成分的系统性分离。

图5 牡丹皮甲醇提取物HPLCFig.5 HPLC chromatogram of Moutan Cortex methanol extract

2.2 系统溶剂萃取评价

TLC 结果显示:有机相与水相成分明显不同，其中丹皮酚主要集中于正己烷相，且以酸性溶液中最显著，pH 增大过程中，化合物的萃取效率增大(图6，每个板点样样品依次为正己烷相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相、丹皮酚、牡丹皮甲醇提取物)，氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相成分区别不大;各水相成分则在pH 变大过程中斑点减少。说明碱性条件利于提高萃取效率。HPLC 结果(图7)显示pH 改变对于正己烷相、氯仿相的影响不大，而乙酸乙酯相和正丁醇相变化显著，以正丁醇萃取有机相为例，色谱峰明显减少，说明pH 增大牡丹皮化学成分改变，萃取适宜在原pH 下进行。牡丹皮甲醇提取物系统萃取最终选择在pH=4 下采用正己烷、乙酸乙酯依次萃取。

图6 萃取评价有机相、水相TLC 结果Fig.6 TLC results of organic phase and water phase of Moutan Cortex methanol extract

图7 不同pH 溶液有机萃取相HPLC 谱图Fig.7 HPLC chromatograms of organic phase extract with different pH

2.3 柱色谱分离条件筛选

2.3.1 待分离组分分析

TLC 分析结果显示正己烷相的Fr1.3 组分在香草醛浓硫酸显色后有6 个斑点，HPLC 结果显示主要有三个色谱峰，通过薄层制备对6 个化合物进行分离，得到6 个化合物的单点，用同样的HPLC 条件进行分析对照，确定了TLC 与HPLC 的对应关系。如图8 所示，TLC 中2、3、4 斑点分别对应HPLC 三个色谱峰。

图8 Fr1.3 组分TLC、HPLC 分析Fig.8 TLC and HPLC analysis results of Fr1.3

2.3.2 分离流动相筛选

采用1.2.5.2 流动相筛选体系，以斑点个数、难分离物质的分离度以及斑点是否拖尾作为评价指标，筛选Fr1.3 分离体系。结果显示S2 氯仿-丙酮体系，斑点数目最多，难分离物质对ΔRf为0.06，确定氯仿-丙酮体系为Fr1.3 组分的洗脱溶剂体系。

2.3.3 洗脱流动相比例筛选

分别以V氯仿:V丙酮=100∶0、99∶1、98∶2、97∶3、95∶5 为展开剂对Fr1.3 组分依次层析展开Rf的结果见表3，待分离化合物为1～6 的Rf在0.10 ＜Rf≤0.85，初始展开剂下的Rf在0.10 ＜Rf≤0.65，初始条件四次展开化合物1～6 的Rf变化在0.06 ＜Rf≤0.89(见表4)，难分离化合物对5、6 的ΔRf经后由0.06 增大为0.10，预示梯度洗脱分离6 个化合物是可能的。

表2 Fr1.3 组分分离系统TLC 溶剂筛选结果Table 2 Systemic screening results of TLC developing solvents for Fr 1.3

表3 Fr1.3 组分不同溶剂梯度连续展开TLC 的Rf值Table 3 Rf values of the six components in Fr1.3 under different developing solvents

表4 Fr1.3 组分初始洗脱条件下的四次展开结果Table 4 Rfvalues of the six components in Fr1.3 with four times development with initial solvent

2.4 台阶梯梯度预测结果

由台阶梯梯度公式计算Fr1.3 中目标化合物在两台阶梯度洗脱分离时的保留体积VR，结果见表5。

表5 多阶梯梯度保留体积预测结果Table 5 Prediction results of retention volume by multi-step gradients

2.5 制备柱色谱分离

选定台阶梯度洗脱条件下，1/3 理论上样量0.55 g、理论上样量1.65 g、最大上样量3.95 g 的三次制备柱色谱分离实践表明，Fr1.3 组分中的6 个化合物均得到TLC 单点的纯化合物，其中2、3、4 等3 个化合物的HPLC 纯度在95%以上。台阶梯度预测结果与实际保留体积一致(表6)，1、5、6 号化合物无紫外吸收。

图9 从Fr1.3 分离出的化合物1～6 的TLC 图Fig.9 TLC chromatograms of compounds 1-6 separated from Fr 1.3

表6 Fr1.3 组分三次制备柱分离结果Table 6 Results of three times medium-pressure liquid chromatography separation experiments

3 结论

本文以牡丹皮甲醇提取物为对象，研究建立了中药复杂体系中化学成分系统色谱分离的前处理方法，构建了基于TLC、HPLC 分析的复杂体系制备色谱分离条件筛选体系，确定了牡丹皮正己烷相的色谱分离填料、洗脱溶剂体系和系统化色谱分离等条件;建立的系统化TLC 方法可以快速选定制备柱色谱的分离条件;台阶梯度洗脱分离情况下，分离目标化合物在初始洗脱溶剂下，其0.10 ＜Rf≤0.65 时，多阶梯梯度预测方法准确预测了Fr1.3 组分制备柱分离各化合物的保留体积。该研究方法同样适用于其他中药组分的系统分离。

1 Wang YP (王艳萍)，Feng JT (丰加涛)，Jin Y (金郁)，et al.Approaches to the study on material foundation of Chinese medicines.Chin J Nat Med (中国天然药物)，2009，7:13-18.

2 Li HY(李海燕)，Guo Z (郭桢)，Zhang JW (张继稳)，et al.Research of traditional Chinese medicine in terms of herbalomics.World Sci Technol Mod Tradit Chin Med Mater Med，2010，12:160-164.

3 Weber P，Hamburger M，Schafroth N，et al.Flash chromatography on cartridges for the separation of plant extracts:Rules for the selection of chromatographic conditions and comparison with medium pressure liquid chromatography.Fitoterapia，2011，82:155-161.

4 Fair JD，Kormos CM.Flash column chromatograms estimated from thin-layer chromatography data.J Chromatogr A，2008，1211:49-54.

5 He CN，Peng Y，Zhang YC，et al.Photochemical and Biological Studies of Paeoniaceae.Chem Biodiver，2010，7:805-839.

6 Sun YQ (孙毓庆).Modern Chromatography and Its Application for Pharmaceutical Analysis.(现代色谱法及其在药物分析中的应用).Beijing:Science Press，2005:28-30.

7 Lu PZ (卢佩章).High Perform Liquid Chromatography and Expert System (高效液相色谱法及其专家系统).Dalian:Liaoning Science and Technology Press，1992.322-350.