素馨花提取物橄榄苦苷在大鼠体内药代动力学研究

郝 婷，尹营松，李亚洲，刘丽艳，陈四平，赵桂琴

1承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室，承德 067000;2 河北师范大学药物研究所，石家庄 050011

橄榄苦苷是一种裂环环烯醚萜苷类化合物，作者从素馨花(Jasminum officinale L.var.grandiflorum)70%乙醇提取物中分离得到。该物质体内外抗乙型肝炎病毒(HBV)活性明确，在素馨花药材中含量丰富(初步估算超过5%)［1］，易于分离纯化，有望成为新型抗HBV 活性先导化合物。本文建立了测定橄榄苦苷含量的HPLC 方法，并应用该方法对橄榄苦苷在大鼠体内的药代动力学过程进行了研究。

1 材料

1.1 药品与试剂

甲醇(色谱纯，Dikmapure);甲醇(分析纯，天津赛孚试剂厂);甲酸(分析纯，天津市佳兴化工厂);市售纯净水;橄榄苦苷(实验室自制，纯度大于98%);内标物黄芩苷(中国药品生物制品检定所，批号:110715-201016)。

1.2 仪器

Agilent 1200 型高效液相色谱仪(HPLC);HC-2062 高速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司);梅特勒-托利多AG245 型分析天平(瑞士);KQ-100E 超声清洗器(昆明市超声仪器有限公司)。

1.3 实验动物

SPF 级雄性Wistar 大鼠120 只，体重180～200 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，合格证:0237506。

2 实验方法

2.1 色谱条件

Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm ×150 mm，5 μm)色谱柱;流动相:水-甲醇-甲酸(63∶37∶1);检测波长:276 nm;流速:1 mL/min;柱温:30 ℃;进样量:20 μL。

2.2 给药及样品采集

根据预实验结果，确定大鼠灌胃低、中和高剂量分别为100、200 和400 mg/kg。取Wistar 大鼠120只，随机分成低、中、高剂量组，每组40 只给药前12h 禁食，自由饮水。将橄榄苦苷配制为相应浓度的溶液，i.g.给药，给药容积为10 mL/kg，给药后自由饮水，分别于i.g.后5、10、15、30、60、120、240、480 min 采用400 μL 一次性负压采血管(肝素钠抗凝)，腹主动脉取血400 μL(每个时间点5 只)，于2500 rpm 离心15 min，分离血浆，-20 ℃保存。

2.3 血浆样品预处理［2-5］

精密吸取空白血浆100 μL，依次加入1 mol/L磷酸二氢钾溶液50 μL 及5 μL 内标物，涡旋20 s，依次加入甲醇100 μL，乙腈350 μL，涡旋5 min，超声20 min，3000 rpm 离心，取上清液，40 ℃氮气挥干，残渣用500 μL 流动相复溶，14000 rpm 离心，取上清液，进样20 μL，HPLC 法测定。

2.4 血浆样品中橄榄苦苷标准曲线的制备

精密吸取空白血浆100 μL，加入不同浓度橄榄苦苷系列标准溶液25 μL 和0.12 mg/mL 的内标溶液5 μL，配置成橄榄苦苷血浆标准系列，浓度分别为5.25、10.5、16.75、21、26.25、52.5 μg/mL，每一浓度平行配置3 份，按“血浆样品处理”项操作后，取上清液，进样20 μL，每个样品进样3 次，HPLC 测定，记录峰面积，取平均值。

2.5 精密度与准确度

制备橄榄苦苷低、中、高3 个浓度(5.25、16.75、26.25 μg/mL)为质量控制(QC)样品，每个浓度平行处理5 份，按照“血浆样品处理”项操作，每个样品测定一次，于一个工作日内完成，计算日内精密度。同样的QC 样品连续重复3 d，计算日间精密度。

2.6 方法回收率的测定

制备橄榄苦苷低、中、高3 个浓度(5.25、16.75、26.25 μg/mL)为质量控制(QC)样品，按“血浆样品处理”项操作，以提取后的色谱峰面积与内标溶的峰面积比值带入回归方程，所得浓度与实际浓度的比值即为方法回收率。

2.7 稳定性试验

考察橄榄苦苷低、中、高3 个浓度(5.25、16.75、26.25 μg/mL)QC 样品的稳定性，以橄榄苦苷的峰面积为指标，血浆样品处理后，4 ℃放置3 d，HPLC检测，记录峰面积。

2.8 数据分析

灌胃给药后橄榄苦苷的血药浓度-时间数据用3P97 药代动力学软件分析。组间药动学参数用SPSS 17.0 软件进行统计分析。

3 结果

3.1 血浆样品中橄榄苦苷的标准曲线

以血浆样品中橄榄苦苷浓度为横坐标，待测物与内标的峰面积比值为纵坐标，求得橄榄苦苷标准曲线为y=0.0442x-0.038(R2=0.9991)，线性范围5.25～52.5 μg/mL，信噪比S/N=3 时定量限为5.25 μg/mL。

3.2 精密度与准确度

血浆中低、中、高浓度的橄榄苦苷的日内、日间精密度RSD 值均小于±5%，准确度RE 值均小于±10%，其中，血浆中低、中、高浓度的橄榄苦苷的日内峰面积RSD 分别为1.96%、2.34%、1.87%;血浆中低、中、高浓度的橄榄苦苷日间峰面积RSD 分别为2.89%、3.67%、2.96%。

3.3 方法回收率的测定

血浆中低、中、高浓度的橄榄苦苷的提取回收率分别为96.9%、98.2%、102.7%。

3.4 稳定性试验

血浆中橄榄苦苷低、中、高3 个浓度(5.25、16.75、26.25 μg/mL)QC 样品的稳定性，以橄榄苦苷的峰面积为指标，血浆样品处理后，4 ℃放置3 d，橄榄苦苷的RSD 分别为7.1%、8.4%、3.92%。

3.5 药时曲线及药代动力学参数

大鼠灌胃给予低、中、高3 个剂量橄榄苦苷后的平均血药浓度-时间曲线(图2)，所得实验数据用3P97 药代动力学软件进行处理，所得药动学参数见表1，经3P97 软件拟合，体内药代动力学过程符合二室模型，结果显示半衰期t1/2分别为15.189、32.829、55.097 min，清除率CL/F 分别为0.0174、0.0526、0.0653 μg/(μL·min)，随剂量的增大而延长，药物浓度-时间曲线下面积AUC 分别为5759.51、3804.57、6250.72 μg/(min·μL)，随剂量的增大先减小后增大，显示出非线性药代动力学特征

表1 大鼠灌胃不同剂量橄榄苦苷药动学参数(n=5，)Table 1 Main pharmacokinetic parameters of oleuropein after i.g.administration of different dose of oleuropein extract to rats (n=5，)

注:与中、高剂量组比较，* P ＜0.05。Note:Compare with middle，high dose group，* P ＜0.05.

图1 大鼠灌胃不同剂量橄榄苦苷体内的平均药时曲线Fig.1 Mean plasma concentration-time curve of oleuropein after i.g.administration

4 讨论

由于大鼠个体间存在差异可能导致数据偏差，本实验中的大鼠均采用完全随机法进行分组。取各组大鼠血药浓度的平均值，用3P97 药动学软件处理数据，求出药动学参数，尽可能减少由于大鼠个体差异所造成的数据偏差。

研究结果表明，大鼠灌胃不同剂量橄榄苦苷时，橄榄苦苷的t1/2随给药剂量增大而显著延长，AUC先减小后增大，推测橄榄苦苷在大鼠体内为非线性动力学过程［6］。

实验结果显示，中、高剂量组(200 mg/kg 和400 mg/kg)大鼠血浆的药时曲线出现双峰现象，而低剂量组(100 mg/kg)未出现双峰现象。药物的吸收出现多峰现象存在多种原因，如肝肠循环、多部位吸收、体内再分布等。中、高剂量组的双峰现象可能是因为橄榄苦苷在大鼠体内的药代动力学存在肝肠循环，或快速分布至其它脏器后再次吸收入血。相关研究有待深入进行。

本实验也做了方法专属性考察，结果表明血浆中内源性杂质不干扰橄榄苦苷的含量测定，内标物与橄榄苦苷分离完全，峰形良好，该方法适用于本实验。

本研究均按照2010 版药典的附录XIX B，即生物样品分析方法的基本要求，进行操作［7］，符合国内检测标准。

1 Zhao GQ(赵桂琴).Studies on the chemical constituents and anti-HBV activity of Jasminum officinale L.var.grandiflorum.Beijing:Academy of Military Medical Sciences (军事医学科学院)，PhD.2008.

2 Zhao XY(赵绪元)，Yao JC(姚金成)，Hu L(胡领)，et al.Determination of Baicalin of Yinhuan granules in rat plasma by HPLC and study on its pharmacokinetics.Nat Prod Res Dev (天然产物研究与开发)，2007，19:645-647.

3 Zhang Y(张杨)，Zhang ZQ(张振秋)，Sun ZS(孙兆姝)，et al.Pharmacokinetic of berberine in combination of Cortex Phellodendri and Rhizoma atractrylodis in rat.Chin Tradit Pat Med(中成药)，2009，31:1351-1354.

4 Tian JZ(田景振)，Wei FH(魏凤环).Study on pharmacokinetics of puerarin sustained-release capsules in rabbits after intravenous administration.J Shandong Univ Tradit Chin Med (山东中医药大学学报)，2003，27:4542-4561.

5 Deng XG(邓新国)，Hu SX(胡世兴)，Zhang QJ(张清炯)，et al.Pharmacokinetic study of puerarin in aqueous humor of rabbits following intraperitoneal injection.Chin Ophth Res(眼科研究)，2003，21:2582-2601.

6 Liu YM(刘亦明)，Lin AH(林爱华)，Chen H(陈汇)，et al.Study on pharmacokinetics of scutellarin in rabbits.Acta Pharm Sin(药学学报)，2003，38:775-778.

7 Chinese Pharmacopoeia Commission (国家药典委员会).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (中华人民共和国药典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Appendix XIX B.