番茄红素对高糖所致内皮祖细胞功能障碍的保护作用及机制初探

曾瑶池，穆桂萍，黄淑芬，曾学辉，周熙临

深圳市中医院，深圳 518033

糖尿病患者发生大血管病变的风险明显高于普通人群，糖尿病已被列为心血管疾病的等危征。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一类能增殖并分化为血管内皮细胞，但尚未表达成熟血管内皮细胞表型，也未形成血管的前体细胞，不仅参与人胚胎血管生成，同时也参与出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程，新生血管中25%的内皮细胞是由EPCs 分化而来的［1］。糖尿病血管病变的发生发展过程中EPCs 数量减少和增殖、黏附及血管形成能力受损起主导作用［2］。增加EPCs 数量并改善其功能，可以增强血管再生和损伤血管的再内皮化过程，对糖尿病患者损伤血管的修复和缺血组织侧枝循环的形成发挥重要作用。我们的前期研究已证实番茄红素可以保护高糖环境下EPCs 的增殖能力并抑制其凋亡［3］，本实验旨在观察番茄红素对高糖环境下人外周血EPCs 黏附、迁移和体外小管形成能力的影响，并探索其可能的作用机理。

1 材料与方法

1.1 标本

抽取健康成人空腹肘静脉血15 份，15 mL/份，其中男性8 份，女性7 份。所有供血者均排除吸烟、近期外伤、手术史、皮肤溃疡等影响内皮祖细胞增殖、迁移、血管形成能力及存活率的因素，所采集的血液标本均在l h 以内分离单个核细胞。

1.2 材料与试剂

番茄红素(纯度≥90%，分离纯化于番茄)、人纤维连接蛋白、FITC-UEA-I、Dil-acLDL 和 p38 MAPKs 抑制剂SB203580 均购于Sigma 公司;M199培养基和牛胎血清购自Hyclone 公司;淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物技术公司;VEGF、bFGF、EGF及IGF-1 购自Protech 公司;改良Boyden 小室购自江苏海门麒麟医用仪器厂;磷酸化和非磷酸化p38 MAPK 抗体购自美国CellSignaling Technology 公司。番茄红素纯品溶解于四氢呋喃(THF)中，用培养基稀释至所需浓度，所有操作在暗光下进行。

1.3 EPCs 的培养、鉴定

参照文献［4］，简述如下:取空腹外周静脉血15 mL，常规密度梯度离心法获取单个核细胞，并悬浮于5 mL M199 培养基(含20%胎牛血清、VEGF10、bFGF 2、EGF5 μg/L、青霉素1 ×105μg/L、链霉素100 mg/L)中，将其铺在纤维连接蛋白包被20 min的培养瓶内，37 ℃、饱和湿度、5% CO2温箱中培养4 d。然后以M199 培养基轻轻洗去未贴壁细胞，继续以上述完全培养基培养至第7 d。将Dil-acLDL(2.4 mg/L)加入EPCs 培养体系中，37 ℃孵育1 h。PBS 洗涤3 次后，加入FITC 标记的UEA-I(10 mg/L)，37 ℃继续孵育1 h，4%多聚甲醛固定10 min 后于荧光显微镜下观察。单个核细胞培养7 d 后，用Dil-acLDL 和FITC-UEA-1 对细胞染色，然后通过激光共聚焦显微镜鉴定，可观察到EPCs 特异性生物学特性:能摄取acLDL(激光共聚焦显微镜下呈红色，激发波长543 nm)，结合UEA-I(激光共聚焦显微镜下呈绿色，激发波长477 nm)。FITC-UEA-I 和Dil-acLDL 双染色阳性细胞为正在分化的EPCs。倒置荧光显微镜对EPCs 进行计数，取培养第3 代EPCs 用于实验。

1.4 实验分组及培养

第3 代EPCs 作为靶细胞，细胞随机分为6 个组:空白对照(Normal control，NC)组;高糖(high glucose，HG)组;高糖+番茄红素10 μg/mL 组;高糖+番茄红素30 μg/mL 组;高糖+番茄红素50 μg/mL组;高糖+信号阻断剂(SB203580 1 μmol/L)组。除空白对照组外，葡萄糖终浓度均为33 mmol/L 的M199 培养基(含20%胎牛血清)培养EPCs 24 h。

1.5 EPCs 黏附能力检测

0.25%胰蛋白酶消化搜集贴壁细胞，先悬浮在500 μL 不同番茄红素浓度的培养液中培养24 h，计数。然后将同等数目的EPCs 接种在包被有纤维连接蛋白的96 孔培养板，在37 ℃下培养30 min，洗掉未贴壁细胞，随机选择每孔5 个高倍镜视野(×200)计数贴壁细胞，取平均数。

1.6 EPCs 迁移能力检测

分别将2 ×104EPCs 悬浮在不含VEGF、bFGF的200 μL 培养液中，注入Boyden 上室;将含VEGF、bFGF 的200 μL 培养液，注入下室。培养24 h，刮去滤膜上面的未移动细胞，甲醇固定5 min，Giemsa 染色，随机选择5 个高倍镜视野(×200)计数迁移到下层的细胞，取平均数。

1.7 EPCs 小管形成能力实验

Matrigel 成血管网实验评价EPCs 在体外的小管形成能力。4 ℃下于24 孔培养板底加入0.3 mL Matrigel，铺平于培养箱37 ℃固定10 h，将培养板获得的EPCs 与ECM-2 培养液混合(10000/孔，每孔0.25 mL)。混匀后加入培养板。37 ℃、5%CO2于培养箱培养，24 h 后，用100 倍倒置显微镜观察管样结构形成情况，细胞拉长变形，长度为宽度的4 倍以上即可被认为形成小管。随机选取5 个视野，计数完整微管网状结构。

1.8 Western blot 分析

各组干预24 h 后，冰上裂解细胞，离心取上清测浓度，取30 μg 蛋白与加样缓冲液混匀变性，电泳、转膜、封闭，分别加入磷酸化和非磷酸化p38 MAPK 或β-actin 抗体，4 ℃孵育过夜，加入二抗孵育1 h，进行后续发光、压片、显影、定影，β-actin 为内参。BioRad-Jeldoc2000 图像分析系统进行光密度扫描，蛋白相对表达量以目的蛋白与内参β-actin 的比值表示。

1.9 统计学分析

2 实验结果

2.1 EPCs 的鉴定

用FITC 标记的荆豆凝集素I(FITC-UEA-I)和Dil 标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)双染色鉴定为(激光共聚焦显微镜下呈黄色)正在分化的EPCs［4］，鉴定结果如图1 所示。

图1 激光共聚焦显微镜鉴定EPCs(×200)Fig.1 Characterization of EPCs under laser-scaning confocal microscope (×200)

2.2 番茄红素对EPCs 功能的影响

33 mmol/L 的葡萄糖作用于EPCs 24 h 后，细胞黏附、迁移能力均被抑制，由表1 可见高糖组EPCs黏附、迁移能力明显低于空白对照组、高糖+番茄红素(10、30、50 μg/mL)组和高糖+信号阻断剂组(P＜0.05);番茄红素显著增加EPCs 的黏附、迁移能力，尤以高糖+番茄红素30 μg/mL 组作用最明显，其黏附能力、迁移能力均高于番茄红素10 μg/mL、50 μg/mL 组;高糖+番茄红素30 μg/mL 组与高糖+信号阻断剂SB203580 组比较，迁移能力差异无统计学意义，黏附能力优于信号阻断剂组(P ＜0.05)(表1)。

EPCs 于Matrigel 胶上培养24 h，可形成微血管网状结构，由于番茄红素剂量不同，各组EPCs 的成血管网能力有明显差别。番茄红素显著增强高糖环境下EPCs 的体外小管形成能力并呈一定的量效关系，30 μg/mL 番茄红素组增强EPCs 的体外血管生成能力最为显著(P ＜0.05，表1)，且形成的管腔样结构也较其他剂量组和高糖+信号阻断剂(SB203580 1 μmol/L)组复杂。由图2 可以看出高糖刺激可以显著抑制EPCs 的成血管网能力，而番茄红素30 μg/mL 或信号阻断剂(SB203580 1 μmol/L)干预可以显著改善EPCs 的成血管网能力(表1、图2)。

表1 番茄红素对EPCs 功能的影响(n=15，)Table 1 Effects of lycopene on the functions of EPCs(n=15，)

表1 番茄红素对EPCs 功能的影响(n=15，)Table 1 Effects of lycopene on the functions of EPCs(n=15，)

注:* 与空白对照组比较，P ＜0.05;△与高糖组比较，P ＜0.05;▲与高糖+番茄红素30μg/mL 组比较，P ＜0.05。Note:Compare with control，* P ＜0.05;Compare with high glucose group，△P ＜0.05;Compare with lycopene 30 μg/mL group，▲P ＜0.05.

图2 番茄红素对EPCs 体外小管形成的影响(×100)Fig.2 Effects of lycopene on tube formation activity of EPCs(×100)

2.3 番茄红素对EPCs p38 MAPK 表达的影响

33mmol/L 葡萄糖作用于EPCs 后，p38 MAPK磷酸化表达增加，但对p38 MAPK 总蛋白表达无影响。以不同浓度番茄红素及SB203580 加入高葡萄糖刺激的EPCs 24 h 后，检测p38 MAPK 磷酸化表达，结果显示:随番茄红素浓度增加，其对高葡萄糖所致的p38 MAPK 磷酸化表达抑制作用加强(P ＜0.05)，但浓度增加至50 μg/mL 时抑制p38 MAPK磷酸化表达作用较30μg/mL 组明显降低(P ＜0.05)，SB203580 亦明显抑制p38 MAPK 磷酸化表达(P ＜0.05，图3)。

图3 番茄红素对高糖诱导的EPCs p38 MAPK 激活的影响Fig.3 Effects of lycopene on p38 MAPKs activation in EPCs induced by high concentration glucose (n=15，)

3 讨论

EPCs 又称成血管细胞，是一类能循环、增殖并具有多重分化潜能，但尚未表达成熟血管内皮细胞表型的前体细胞，与血管内皮功能密切相关［5］。EPCs 的生物学特性及其促进缺血组织的血管新生作用使其可作为糖尿病血管病变的治疗靶点。Schattcman 等［6］的研究提示将EPCs 注入糖尿病患者或使用动员剂将EPCs 动员至缺血部位，是改善糖尿病患者血管新生能力的新方法。糖尿病、高脂血症、代谢综合征等均可损伤EPCs 的动员、增殖、分化功能，他汀类调脂药、胰岛素增敏剂可以增加EPCs 数量，增强EPCs 增殖、迁移及分化能力，进而促进缺血组织血管新生，提示这类药物除了惯有的治疗作用外，在糖尿病血管病变的治疗上可能发挥重要作用［7］;糖尿病血管并发症已被逐渐认识，血管内皮细胞生长因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子可以增加其数量、改善其功能;但是上述方案费用较高、副作用较大、限制了其在临床中的应用。

既往研究发现高糖能减少内皮祖细胞的数量并损伤其功能［8］，我们的前期研究亦显示:高糖抑制EPCs 增殖，促进其凋亡;番茄红素可保护高糖环境下EPCs 的增殖能力并抑制其凋亡，抑制高糖诱导的EPCs 数量减少［3］。本实验结果显示番茄红素除了影响高糖环境下EPCs 的数量外，还可以改善其黏附、迁移及小管形成能力。研究已表明p38 MAPK 在调节EPCs 数目的信号传导通路中有中枢性作用［9］。EPCs 中p38 MAPK 磷酸化程度与葡萄糖浓度呈正相关，p38 MAPK 抑制剂SB203580 能抑制高糖诱导的EPCs 衰老，提高EPCs 的增殖和分化，部分逆转EPCs 体内受损的血管新生能力［9］。Kuki 等［10］发现，高血糖通过P38 MAPK 的激活而促进EPCs 的衰老、凋亡。因此，高糖加速EPCs 的凋亡、损伤其功能、导致EPCs 功能障碍，可能与p38 MAPK 的磷酸化有关。

已有研究表明番茄红素对多种原因引起内皮功能障碍具有保护作用［11，12］，最新研究发现，番茄红素可通过抑制p38 MAPK 磷酸化而抑制巨噬细胞炎症因子的生成，发挥抗炎效应［13］。本实验用33 mmol/L 葡萄糖可诱导EPCs 中p38 MAPK 激活。不同浓度的番茄红素干预可阻断高糖诱导p38 MAPK激活。为了进一步明确干扰p38 MAPK 激活介导了番茄红素对高糖环境下EPCs 功能的保护效应，我们用p38 MAPK 阻断剂SB203580 干预，发现阻断p38 MAPK 后，EPCs 的黏附、迁移和体外血管新生能力明显增强，表明p38 MAPK 激活在高糖诱导的EPCs 功能失调中起着重要作用，番茄红素可通过阻断p38 MAPK 激活，进而保护EPCs 功能。然而，我们的实验也显示:SB203580 干预并不能完全阻断高糖对EPCs 功能的损伤，表明高糖对EPCs 的影响机制复杂，p38 MAPK 激活只是途径之一;番茄红素30 μg/mL 组与信号阻断剂SB203580 组比较，迁移能力差异无统计学意义，黏附能力及小管形成能力均优于信号阻断剂组，表明番茄红素除了通过抑制p38 MAPK 磷酸化发挥对EPCs 的保护效应，还存在其他机制。高糖对EPCs 数量与功能的影响是多环节、多通路相互联系的复杂调控过程，番茄红素对EPCs 作用的确切分子机制仍有待进一步研究。

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