虎耳草的化学成分及生物活性研究

先 春，黄志金，周 欣*，龚小见，赵 超，杨占南

1贵州师范大学贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室;2 贵州师范大学天然药物质量控制研究中心，贵阳 550001

虎耳草(Saxifraga stolonifera (L.)Meerb.)为虎耳草科(Saxifragaceae)虎耳草属多年生常绿草本植物，又名金丝荷叶、耳朵红、老虎草、烂耳草、天荷叶等。收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》2003 年版，是贵州特色苗药材，资源丰富。全草入药;微苦、辛，寒，有小毒;祛风清热，凉血解毒［1-2］。近年来，已有报道虎耳草的乙醇提取物中含有多元酚、黄酮、有机酸等成分［3-5］;虎耳草提取物对前列腺癌细胞有诱导凋亡的作用［6］，乙醇提取物有抑菌作用［7］，以及其活性成分槲皮素等对人胃腺癌细胞的增殖具有抑制作用［8］等功效。从目前的研究现状看，为进一步探索虎耳草活性部位的活性成分，对综合利用和评价虎耳草的药用植物资源具有重要的科学意义。

1 仪器与材料

北京泰克仪器有限公司生产的X-4 型双目镜显微熔点测定仪(温度计未校正);美国Varian 公司生产的INOVO 400 MHz 型核磁共振谱仪，以TMS 为内标;美国惠普公司生产的HPMS 5973 质谱仪;德国布鲁克光谱仪器公司生产的TENSOR 27 红外仪。柱色谱硅胶(200～300 目，300～400 目)，薄层用硅胶GF254和薄层用硅胶H 均由青岛海洋化工厂生产;Sephadex LH-20 凝胶由Pharmacia 公司提供;溶剂均为工业纯(重蒸)。虎耳草采集于贵州省都匀市，原植物经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定为虎耳草(Saxifraga stolonifera (L.)Meerb.)，标本保存于贵州师范大学天然药物质量控制研究中心。

2 提取与分离

选取虎耳草全草25 kg(干燥)，粉碎后用80%乙醇热回流提取3 次(每次2 h)，合并提取液后浓缩至无醇味并回收乙醇，浸膏依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部分，各部分的浸膏分别为:400，300，400 g。本研究主要对虎耳草乙酸乙酯部分进行分离纯化，首先用200～300 目硅胶以石油醚∶乙酸乙酯(30∶1～1∶1)，氯仿∶甲醇(30∶1～0∶1)梯度洗脱分段。合并后分得四个部分，即石油醚∶乙酸乙酯(30∶1～15∶1)部分;石油醚∶乙酸乙酯(15∶1～0∶1)部分;氯仿∶甲醇(30∶1～20∶1)部分和氯仿∶甲醇(20∶1～0∶1)部分。弃去第一部分(油脂)和第四部分(大极性)，合并二、三部分以石油醚∶乙酸乙酯(20∶1～1∶1)，氯仿∶甲醇(30∶1～2∶1)经硅胶柱色谱梯度洗脱，分离纯化得到化合物原儿茶酸(1)(50 mg)，琥珀酸(2)(40 mg)，桦木酸(3)(50 mg)，原儿茶酸甲酯(4)(60 mg)。再次合并二、三部分后经凝胶柱色谱以氯仿∶甲醇(5∶1～0∶1)梯度洗脱，得到化合物5，7-二羟基色原酮(5)(10 mg)，槲皮素3-O-β-L-鼠李糖苷(6)(40 mg)，槲皮素5-O-β-D-葡萄糖苷(7)(1.5 g)。虎耳草正丁醇部分以甲醇∶水(1∶0～0∶1)经聚酰胺柱纯化后用薄层显色合并、各段再经MCI、凝胶柱色谱以氯仿∶甲醇(5∶1～1∶1)反复纯化，得到化合物1-O-β-D-glucopyranosyl-(2S，3S，4R，8E/Z)-2-［(2' R)-2'-hydroxytetracosanoylamino)］-8-octadecene-1，3，4-triol(8)(20 mg)。

3 结构鉴定

化合物1 白色针晶(甲醇)，C7H6O4;mp:195～197 ℃。EI-MS m/z:154［M］+，137，109，81.1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:7.41(1 H，s，H-2)，7.40(1 H，d，J=8.0 Hz，H-6)，6.78(1 H，d，J=8.0 Hz，H-5).13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:122.5(C-1)，116.3(C-2)，144.7(C-3)，150.2(C-4)，114.4(C-5)，121.7(C-6)，168.9(C-7)。上述数据与文献［9］报道基本一致，故鉴定该化合物为3，4-二羟基苯甲酸(3，4-dihydroxy benzoic acid)，别名原儿茶酸。

化合物2 白色晶体(甲醇)，C4H6O4;mp:185～187 ℃。EI-MS m/z:118［M］+，100，74，55，45.1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:2.69(4 H，s，CH2×2)。13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:175.4(COOH)，29.1(-CH2)。上述数据与文献［3］报道基本一致，故鉴定化合物为琥珀酸(amber acid)。

化合物3 白色无定形粉末，C30H48O3;mp:278～279 ℃。EI-MS m/z:456［M］+，248，207，175，107，65，43.1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:4.69(1 H，s，H-29a)，4.58(1 H，s，H-29b)，1.68(3 H，s，H-30)，0.99(3 H，s，H-23)，0.95(3 H，s，H-24)，0.93(3 H，s，H-25)，0.84(3 H，s，H-26)，0.73(3 H，s，H-27).13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:38.6(C-1)，27.3(C-2)，78.3(C-3)，38.7(C-4)，55.5(C-5)，18.1(C-6)，34.2(C-7)，40.6(C-8)，50.40(C-9)，36.8(C-10)，20.7(C-11)，25.5(C-12)，38.3(C-13)，42.2(C-14)，29.5(C-15)，32.0(C-16)，56.2(C-17)，26.6(C-18)，48.2(C-19)，150.6(C-20)，30.3(C-21)，37.0(C-22)，26.7(C-23)，15.4(C-24，-26)，15.4(C-25)，14.8(C-27)，179.4(C-28)，18.2(C-29)，108.9(C-30)。上述数据与文献［10］报道基本一致，故鉴定该化合物为桦木酸(betulinic acid)。

化合物4 白色无定形粉末，C8H8O4;mp:132～134 ℃。EI-MS m/z:168［M］+，153，125，97.1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:7.68(1 H，dd，J=7.8，1.8 Hz，H-6)，7.53(1 H，d，J=1.8 Hz，H-2)，6.82(1 H，d，J=7.8 Hz，H-5)，3.90(3 H，s，-OCH3)。13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:121.7(C-1)，112.4(C-2)，147.3(C-3)，151.3(C-4)，114.5(C-5)，123.9(C-6)，168.7(C-7)，55.0(OCH3)。上述数据与文献［11］报道基本一致，故鉴定该化合物为3，4-二羟基苯甲酸甲酯(3，4-Dihydroxybenzoic acid methyl ester)，别名原儿茶酸甲酯。

化合物5 黄色针晶(甲醇)，C9H6O4;mp:256～267 ℃。EI-MS m/z:178［M］+，150，109，69.1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:7.97 (1 H，d，J=6.0 Hz，H-2)，6.32(1 Hd，J=2.0 Hz，H-8)，6.19(1 H，d，J=6.0 Hz，H-3)，6.05 (1 H，d，J=2.0 Hz，H-6)，.13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:156.8(C-2)，110.3(C-3)，182.0(C-4)，162.1(C-5)，98.9(C-6)，164.8(C-7)，93.8(C-8)，158.5(C-9)，105.2(C-10)。上述数据与文献［12］报道基本一致，故鉴定该化合物为5，7-二羟基色原酮(5，7-Dthydroxychromone)。

化合物6 黄色粉末，C21H20O11;mp:166～168℃。IR (KBr):υmaxcm-1:3410，1652，1455，1360，1271，1201，1168，964，917.ESI-MS m/z:447［MH］-，471［M+Na］+，302，273，153，137.1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ:12.64 (1 H，s，5-OH)，7.29(1 H，s，H-2')，7.24(1 H，d，J=8.4 Hz，H-6')，6.84(1 H，d，J=8.4 Hz，H-5')，6.38(1 H，s，H-6)，6.19(1 H，s，H-8).13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ:156.5(C-2)，134.2(C-3)，177.8(C-4)，161.3(C-5)，98.7(C-6)，164.2(C-7)，93.7(C-8)，157.4(C-9)，104.1(C-10)，120.8(C-1')，115.8(C-2')，145.2(C-3')，148.5(C-4')，115.5(C-5')，121.2(C-6')，101.8(C-1'')，70.4(C-2'')，70.6(C-3'')，71.2(C-4'')，70.1(C-5'')，17.5(C-6'')。上述数据与文献［13］报道基本一致，故鉴定该化合物为槲皮素3-Oβ-L-鼠 李 糖 苷(Quercetin 3-O-β-L-rhamnopyranoside)。

化合物7 黄色粉末，C21H20O12;mp:256～267℃。IR (KBr):υmaxcm-1:3397，1623，1559，1457，1334，1276，1075，992，924.ESI-MS m/z:463［MH］-，487［M+Na］+，302，273，153，137.1H NMR(C5D5N，400 MHz)δ:10.95 (1 H，s，7-OH)，9.56(1 H，s，3-OH)，7.64(1 H，s，H-2')，7.50(1 H，d，J=7.6 Hz，H-6')，6.87(1 H，d，J=7.6 Hz，H-5')，6.73(1 H，s，H-8)，6.63(1 H，s，H-6)，4.77(1 H，s，H-1'').13C NMR(C5D5N，100 MHz)δ:143.6(C-2)，137.4(C-3)，171.8(C-4)，158.5(C-5)，103.1(C-6)，162.5(C-7)，97.3(C-8)，157.2(C-9)，106.4(C-10)，122.1 (C-1')，114.8 (C-2')，145.1 (C-3')，147.4(C-4')，115.7(C-5')，119.6(C-6')，103.9(C-1'')，73.8(C-2'')，75.7(C-3'')，69.7(C-4'')，77.6(C-5'')，60.8(C-6'')。上述数据与文献［14］报道基本一致，故鉴定该化合物为槲皮素5-O-β-D-葡萄糖苷(Quercetin 5-O-β-D-glucopyranoside)。

化合物8 白色无定型粉末，C48H93NO10;IR(KBr):υmaxcm-1:3417，2923，1633，1405，1199，1100。ESI-MS m/z:842［M-H］-，882［M+K］+.1H NMR(C5D5N，400 MHz)δ:8.58(1 H，d，J=9.2 Hz，-NH)，5.50(2 H，m，H-8)，5.29(1 H，m，H-2)，4.95(1 H，d，J=8.0 Hz，H-1'')，4.71(1 H，m，H-1b)，4.57(1 H，m，H-2')，4.52(各1 H，m，H-1a)，4.34(1 H，m，H-6''b)，4.29(1 H，m，H-6''a)，4.18～4.20(3 H，m，H-4，3''，4'')，3.99(1 H，t，J=8.0 Hz，H-2'')，3.86(1 H，m，H-5'')，1.23～1.30((CH2)n，brs)，0.85(6 H，t，J=6.8 Hz，CH3×2);13C NMR(C5D5N，100 MHz)δ:70.5(C-1)，51.7(C-2)，75.9(C-3)，72.4(C-4，2')，33.9(C-5)，26.7(C-6)，27.6(C-7Z)，32.2(C-7E)，130.4(C-8Z)，130.9(C-8E)，130.2(C-9Z)，130.7(C-9E)，28.0(C-10Z)，33.1(C-10E)，34.0(C-11)，33.4(C-12)，175.8(C-1')，35.6(C-3')，25.9(C-4')，26.8～30.2(C-5'～22'和C-13～16)，23.0(C-17，23')，14.4 (C-18，24')，105.6(C-1'')，75.2(C-2'')，78.5(C-3'')，71.4(C-4'')，78.6(C-5'')，62.6(C-6'')。上述数据与文献［15］报道基本一致，鉴定该化合物为1-O-β-D-glucopyranosyl-(2S，3S，4R，8E/Z)-2-［(2'R)-2'-Hydroxytetracosanoylamino)］-8-octadecene-1，3，4-triol。

4 抗前列腺癌细胞的活性测定(MTT法)

细胞增殖检测［16］(MTT 法测定PC-3 前列腺癌细胞增殖)调整细胞密度为5 ×104·mL-1，接种在96 孔培养板上，每孔200 μL，每组三个复孔，各组加入不同浓度药物培养48 h，72 h 于培养结束前4 h加入MTT(1 mg/mL)20 μL。弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡后在酶标仪490 nm 波长测定OD 值，并做t 检验，计算细胞生长抑制率［17］，结果见表1。

表1 虎耳草不同化合物对PC-3 前列腺癌细胞凋亡的影响()Table 1 Different compounds of Saxifraga stolonifera (L.)Meerb.on PC-3 prostate cancer cell apoptosis()

表1 虎耳草不同化合物对PC-3 前列腺癌细胞凋亡的影响()Table 1 Different compounds of Saxifraga stolonifera (L.)Meerb.on PC-3 prostate cancer cell apoptosis()

结果显示，槲皮素3-O-β-L-鼠李糖苷(化合物6)和槲皮素5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物7)对PC-3 前列腺癌细胞的生长有一定的抑制作用。

5 抑菌活性研究

5.1 试剂、材料与菌种

试剂:DMSO 等均为分析纯。

材料:M-H 培养基、营养琼脂购于杭州微生物试剂厂，庆大霉素等。

菌种:大肠杆菌(CMCC 44113)、枯草芽孢杆菌(CMCC 63501)、伤寒沙门氏菌(CMCC 50071)、金黄色葡糖球菌(CMCC 26112)、铜绿假单胞菌(CMCC 10211)、藤黄八叠球菌(CMCC 28001)，［菌种均购自中国菌种保藏中心］。

5.2 试验方法

采用平板打孔法，选用内径6 mm，外径7 mm的牛津杯，选用处于对数生长期的试验菌种，细胞密度为1.0 ×106～1.0 ×108个/mL，试验样品用二甲基亚砜(DMSO)试剂溶解。样品准确称取5 mg，用0.5 mL DMSO 溶解，浓度配制为:10 mg/mL，每孔加入样品溶液40 μL。选用DMSO 为空白对照，庆大霉素为阳性对照，每孔加入庆大霉素也为40 μL。在枯草芽孢杆菌实验中的浓度0.025 mg/mL，在其余五种菌的实验中浓度为0.25 mg/mL，通过观察各种抑菌圈的半径，得出抑菌效果，结果见表2。

5.3 抑菌作用实验结果及结论

表2 虎耳草不同浸膏及化合物的抑菌活性筛选Table 2 Different extracts and compounds of Saxifraga stolonifera (L.)Meerb.on antibacterial activity screening

抑菌实验研究发现:虎耳草80%醇提物的乙酸乙酯萃取部分对枯草芽孢杆菌抑菌圈大小为12.36±1.60、对金黄色葡糖球菌抑菌圈大小为12.58 ±1.60、对藤黄八叠球菌抑菌圈大小为11.78 ±1.60，由此说明虎耳草乙酸乙酯萃取部位具有潜在的抑菌作用。其中，化合物2(琥珀酸)对枯草芽孢杆菌抑菌圈大小为8.87 ± 0.72，表明此化合物对枯草芽孢杆菌有潜在的抑制作用。

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