鸡足葡萄黄酮类成分的分析
2014-01-09胡松梅李思长禹华芳
胡松梅，李思长，禹华芳
1湖南娄底职业技术学院，娄底 417000;2湖南九鼎科技有限公司，岳阳 414000
鸡足葡萄(Vitis lanceolatifoliosa C.L)为葡萄科葡萄属多年生木质藤本植物［1］，民间常当作一种很好的保健品饮用，是最近发现的一种新型甜味剂植物，具有较大的开发利用价值，其黄酮含量的测定国内未见报道。本文通过分光光度法，对不同产地，不同时期叶、茎总黄酮含量进行测定比较，以期得到含量最高的部位，含量最高的产地，为鸡足葡萄将来更好的开发和利用奠定良好的基础。本试验对鸡足葡萄的黄酮类成分进行了初步研究，为进一步进行其黄酮类化学成分的分离、鉴定打下良好的基础。
1 材料与方法
1.1 材料、仪器与试剂
1.1.1 材料与主要仪器
鸡足葡萄采自湖南邵阳和衡山，为春、夏嫩茎叶混合样。鉴定者为湖南农业大学蒋道松教授，凭证样品保存于湖南农业大学。主要仪器为UV-2100双光束紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);LC-20AT 液相色谱仪(日本岛津);2537A 短波紫外分析仪(上海分析仪器厂);载玻片;玻板;点样毛细管，层析缸，层析用纸。
1.1.2 主要试剂
甲醇(FCP)、盐酸(AR)、氢氧化钠(AR)、镁粉(CP)、锌粉(CP 无铅)、硼酸(AR)、薄层层析硅胶G，柱层析聚酰胺(80～100 目)等。
1.2 实验方法
1.2.1 样品处理
取鸡足葡萄干粉500 g，75%乙醇浸泡过夜，料液比1∶10，80 ℃溶剂回流两次，每次4 h，合并，减压过滤回流提取液得粗提液1、2，将粗提液1 用石油醚萃取数次直至萃取液石油醚无色为止，除去脂溶色素，将水层挥发除去残留石油醚，再用乙酸乙酷等体积萃取数次，至乙酸乙脂层色淡为止，旋转蒸发，回流回收乙酸乙脂，得乙酸乙脂浸膏。
1.2.2 乙酸乙脂浸膏的处理
取部分粗提液的乙酸乙酷浸膏用甲醇溶解后加少许聚酰胺拌样，挥干溶剂，上聚酰胺柱，用乙醇梯度依次洗脱，洗脱开始后，即按50 mL/份接收洗脱液，同时用检测黄酮类物质的特征反应(HCl-MgCl2)随时检测流出液的情况，至第35 馏份时开始呈特征反应，以上共接受160 瓶洗脱液。
1.2.3 粗提液定性检验
通过紫外分析仪检视反应、盐酸-锌粉反应、与金属离子的络合反应、四氢硼钠反应、Molish 反应等来进行黄酮类别的确认。
1.2.4 薄层层析鉴别
1.2.4.1 薄层层析鉴别系统的选择
使用硅胶G 薄层板(点样量0.5 μL)，经过试验，选定3 组展开系统，将粗提液间隔1 cm 多次点样，待样点充分干燥后，将硅胶薄层板直立于盛有展开剂的层析缸中，浸没薄层板下端0.3 cm，上行展开，至展开剂上行至7.5 cm 时，取出聚酰胺薄层板，用吹风机吹干后于紫外分析仪下检视。
1.2.4.2 不同产地总黄酮的薄层层析鉴别比较
将粗提液1(湖南衡山)、粗提液2(湖南邵阳)间隔1 cm 多次点样(点样量0.5 μL)，待样点充分干燥后，将硅胶薄层板直立于盛有展开剂的层析缸中，以石油醚∶乙酸乙脂∶甲酸=3∶12∶1 为展开剂展开，浸没硅胶薄层板下端0.3 cm，上行展开，至展开剂上行至7.5 cm 时，取出硅胶薄层板，用吹风机吹干后于紫外分析仪下检视。
1.2.4.3 洗脱液不同馏份的薄层层析鉴别分析
在以上160 馏份中，从第35 份开始，间隔用TLC 方法检测(吸附剂∶硅胶GF254-CMC-Na，显色剂:l% AlCl3/EtOH，展开剂见表1)。
表1 各薄层层析方法检测所用展开剂Table 1 Elution solvents for different TCL methods
1.2.5 紫外光谱扫描
将1 mg 乙酸乙酷浸膏用甲醇(FCP)溶解过滤制得样品液，又以甲醇(FCP)作参比液，用UV-2100双光束紫外可见分光光度计，在波长200～500 nm范围，对芦丁、槲皮素、二氢杨梅素标准液和样品液进行紫外光谱扫描。
1.2.6 鸡足葡萄总黄酮成份的HPLC 分析
色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18，流动相:甲醇∶水=60∶40，体积流量:0.09 mL/min，检测波长:254、290、360 nm。
分别精密称取经五氧化二磷干燥24 h 的槲皮素、芦丁、二氢杨梅素对照品，各加甲醇制成200、100、50 μg/mL 的储备液。以流动相为稀释液配之每1 mL 分别含4 μg 槲皮素、4 μg 芦丁、1 μg 二氢杨梅素的混合液，作为对照品溶液。
1.2.7 洗脱液不同馏份的HPLC 分析
色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18，流动相:甲醇∶水=60∶40，流速:0.08 mL/min，检测波长:254 nm。
在以上160 馏份中，从第35 份开始，间隔取5 mL，转入50 mL 容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.145 μm)滤过，取滤液作为供试品溶液。
1.2.8 鸡足葡萄的芦丁含量的测定
色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18，流动相:甲醇∶水=60∶40，体积流量:1.00 mL/min，检测波长:257 nm。
1.2.8.1 芦丁标准曲线的制定
称取120 ℃减压干燥至恒重的芦丁对照品14.95 mg，置50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解至刻度。精密吸取上述芦丁对照品溶液3、6、10、15、20、25 μL(进样量分别为0.897、1.794、2.990、4.485、5.980、7.475 μg)进样检测，测得峰面积以对照品量(μg)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，计算回归方程。
1.2.8.2 精密度试验
取浓度为45.07 mg/L 的对照品溶液，重复进样5 次，计算峰值面积，计算RSD。
1.2.8.3 稳定性试验在本试验条件下，供试品溶液室温放置8 h，每隔2 h 进料20 μL，记录峰面积，计算RSD。
1.2.8.4 回收率试验
精确称取己知含量的样品5 份，加入1.5 mg 芦丁对照品，测定芦丁的含量，计算回收率及RSD 值。
1.2.8.5 样品中芦丁含量的测定
取产自湖南邵阳的鸡足葡萄叶，茎混合干份5份，每份1 g，75%乙醇浸泡过夜，料液比1∶10，80 ℃溶剂回流两次，每次4 h，合并，减压过滤回流提取液得粗提液，移入100 mL 的容量瓶中，甲醇定容，得供试品溶液。
2 结果与分析
2.1 黄酮类化合物定性检验结果
粗提液1、2 的定性检验结果见表2。由表2 可以看出，该植物粗提液中含C5-OH 黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、黄酮苷类等，但浓盐酸反应溶液并没有明显的粉红色生成，表明其不含花青素或含量很少。
表2 黄酮类物质的定性检验结果Table 2 Qualitative analysis results of flavonoid component
2.2 薄层鉴别
2.2.1 薄层层析鉴别系统的选择
经过初步试验，选定3 组展开系统，分别是石油醚∶乙酸乙脂∶甲酸=3∶12∶1;石油醚∶乙酸乙脂∶甲酸=3∶18∶1;乙酸乙脂∶丙酮∶甲酸∶水=8∶3∶1∶1。3个系统均有3 个荧光斑点，但斑点1 较大，拖尾较严重，可能是多种物质混合所致，对3 个系统的样品的每个荧光斑点。展开系统石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸=3∶12∶1 的分离度较其它两个系统大，分离效果好，且稳定，因此更加适合该物种黄酮类物质的薄层鉴别分离。
2.2.2 不同产地总黄酮的薄层层析鉴别比较
将粗提液1(湖南衡山)，粗提液2(湖南邵阳)分别在展开系统石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸=3∶12∶1中进行分离，上行展开，取出硅胶薄层板，用吹风机吹干后于紫外分析仪下检视，结果显示，粗提液2 的斑点数目比粗提液1 的斑点数目要高，且分离效果比粗提液1 要好，说明粗提液1 中的黄酮化学物质的种类数较粗提液2 中丰富，同时表明采自湖南邵阳的鸡足葡萄的黄酮类化学成分的种类较丰富，有进一步开发的潜力。
2.2.3 洗脱液不同馏份的薄层层析鉴别分析
在以上160 馏份中，从第35 份开始，间隔用TLC 方法检测。馏分69、70 最上部的斑点消失，最后根据各个馏份的薄层检测结果，合并相同馏份，留下浓缩液2、3、4。
2.3 紫外光谱扫描
将乙酸乙脂萃取液用甲醇(FCP)溶解过滤制得样品液，又以甲醇(FCP)作参比液，用UV-2100 双光束紫外可见分光光度计，在波长200～400 nm 范围，对芦丁、槲皮素、二氢杨梅素标准液和乙酸乙酯提取液进行紫外光谱扫描。见图1。
图1 鸡足葡萄乙酸乙酯提取液的紫外吸收光谱Fig.1 UV spectrum of ethyl acetate extract of V.lanceolatifoliosa
由图1 可以看出，鸡足葡萄乙酸乙酯提取液在226、290、350 nm 处有特征吸收峰，峰值分别为3.9829、2.5604、1.0994，在350 nm 处的吸收峰较弱，而226 nm 处可能是溶剂所形成的峰，符合双氢黄酮类的紫外光谱特征，由此推断该提取液的黄酮类成分的主要物质为双氢黄酮类。
2.4 鸡足葡萄总黄酮成分的HPLC 分析
经初步分析，将甲醇溶解后的乙酸乙酯萃取液在254 nm 波长下进行检测，结果见图2、3。
图2 芦丁标准液的HPLC 色谱图(254 nm)Fig.2 HPLC chromatogram of rutin standard
图3 乙酸乙酷提取液的HPLC 色谱图(254 nm)Fig.3 HPLC chromatogram of ethyl acetate extract of V.lanceolatifoliosa
结合图2 可以看出，芦丁标准液和乙酸乙酯提取液的出峰时间一致由此可以推断该峰为芦丁，该鸡足葡萄中有芦丁存在，而其它峰的出峰时间与槲皮素，二氢杨梅素标准品的出峰时间并不一致，可判定该物种中并不存在上述两种物质。
2.5 洗脱液不同馏份的HPLC 分析
色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18，流动相:甲醇∶水=60∶40，体积流量:0.09 mL/min，检测波长:254 nm。浓缩液2、3、4 的HPLC 色谱结果见图4。
图4 浓缩液2(A)、3(B)及4(C)的HPLC 色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of extract 2(A)，3(B)and 4(C)
从上图可知，芦丁主要存在于浓缩液3、4 中，在浓缩液3、4 中的主峰之一(出峰时间5.568 min，5.495 min)的物质是该物种黄酮类的主要物质，综合乙酸乙酯萃取液的紫外光谱扫描研究，进而确定该物质为二氢黄酮类，但该物质和其它主峰物质的详细结构仍然需要通过制备液相色谱、核磁共振等手段进行进一步的研究。
2.6 鸡足葡萄的芦丁含量的测定
2.6.1 芦丁对照品的全波段扫描
根据扫描结果和扫描数据发现芦丁对照品在218、257、358 nm 处有吸收峰，其中257 nm、358 nm处为黄酮类的特征峰，218 nm 处可能是溶剂所形成的峰，且最大吸收峰出现在257 nm 处，故选择257 nm 做为测定波长。
图5 芦丁(0.06 mg/mL)对照品UV 扫描图Fig.5 UV spectrum of rutin standard(0.06 mg/mL)
2.6.2 芦丁标准曲线的制作
按前述方法，测定芦丁的吸收峰面积分别为32.291、50.342、71.991、100.170、127.121、152.512，计算得到回归方程，表明芦丁含量在0.897～7.475 μg/mL 范围内与吸光度线性关系良好。
2.6.3 精密度试验
5 次的峰值面积分别为33.717、33.661、33.351、33.153、33.258，计算RSD=0.73%(n=5)。
2.6.4 稳定性试验
在本次试验条件下，测得5 次的供试品溶液的峰面积为33.221、33.214、32.730、32.215、32.126，计算RSD=1.53%。
2.6.5 回收率试验
回收率结果见表3。
表3 回收率试验结果Table 3 Test result of recovery rate
2.6.6 样品中芦丁含量的测定
计算得该样品中的芦丁含量为4.27 mg/g，RSD=l.2%，表明该方法重复性良好。
3 讨论
黄酮类化合物是一类在植物界中分布广泛、具有多种生物活性的多酚类化合物。如白果双黄酮和葛根总黄酮等，对心血管疾病有治疗作用;木犀草素、轻基芫花素和杜鹃素等能治疗气管炎;竹叶黄酮具有优良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、降血脂、免疫调节、抗菌等生物学功效，在人类的营养、健康和疾病防治上有着广阔的应用前景［2-4］。
鸡足葡萄含有的黄酮类化合物是多样的，并多以苷的形式存在，通过定性检验、薄层色谱分析、紫外光谱扫描、液相色谱和物理性质检测。结果证实，鸡足葡萄所含黄酮类化合物的成分主要为黄酮、黄酮醇类(芦丁)、二氢黄酮类等，而二氢黄酮类的含量较其它成分要高，初步确定黄酮类甜味成分为二氢黄酮类，并测得芦丁含量为4.27 mg/g。
1 Flora of China Editorial Committee(中国植物志编委会).Flora of China(中国植物志).Beijing:Science Publishing House，1959.
2 Middleton JR.Biologieal properities of plant flavonoid:a noverview.Int J Phannaeognos，1996，(34):344-348.
3 HAVESTEEN B.Flavonoids，a class of natural produets of high phannaeologieal poteney.Biochemieal Phanneology，1983，32:1141-1148.
4 Zhang Y(张英)，Wu XQ(吴晓琴)，Yu ZY(俞卓裕).Comparison study on total flavonoid content and anti-free redical activity of the leaves of Bamboo，phyllostachys nigra，and Ginkgo bilabo.Chin J Chin Mater Med(中国中药杂志)，2002，27:254-257.
