柴胡属植物HPLC 指纹图谱及聚类分析

王 砚，王书林

1成都中医药大学药学院，成都 611137;2 四川省食品药品检验检测院，成都 611731

我国柴胡属植物分布广，种类多，有36 种、17变种、7 变型，但《中国药典》2010 年版仅收载了北柴胡(Bupleurumchinense DC.)和狭叶柴胡(Bupleurumscorzonerifolium Willd.)两个来源［1］，其资源远远不能满足市场需求。竹叶柴胡(Bupleurummarginatum Wall.exDC.)在中国西南地区分布广泛，具有悠久的用药历史，是目前市场上柴胡药材的主要来源之一，但并非为药典正品柴胡，故不能作为柴胡药材在制剂生产中投料，在市场应用上受到一定限制。本文选择竹叶柴胡(B.marginatumWall.exDC.)进行研究，首先利用中国药典正品柴胡样品(北柴胡)建立标准指纹图谱，将其与标准指纹图谱进行相似度比较，以评估其内在质量，考察其作为柴胡资源补充的可能性。同时增加其他几种基源如马尾柴胡(B.microcephalum Diels.)、马尔康柴胡(B.malconense Shan et Y.Li.)、抱茎柴胡(Bupleurumlongicaule var.amplexicaule C.Y.Wu)，通过相似度结果评价不同基源的柴胡质量的一致性和差异性，再进行聚类分析，考察各不同基源柴胡亲缘关系，验证聚类分析方法作为基源鉴定的可行性，为柴胡基源鉴定提供科学依据，并可用于选育优质的柴胡品种。

据报道，竹叶柴胡的化学成分主要为五环三萜类齐墩果烷型衍生物，含量较高的为柴胡皂苷a、c、d［2］，现代药理研究表明柴胡皂苷具有解热、抗炎、保肝、免疫调节、抗肿瘤以及镇静、抗惊厥等多方面药理活性［3-6］。《中国药典》2010 年版柴胡项下鉴别和含量测定成分为柴胡皂苷a、d，功能与主治为疏散退热，疏肝解郁，升举阳气。竹叶柴胡的化学指标成分及药理作用跟药典正品柴胡具有一致性，但竹叶柴胡习惯以全草入药，目前对于竹叶柴胡的研究亦均为全草，而药典收载的柴胡品种以根入药，故对竹叶柴胡根部的化学成分研究缺乏针对性。故本文所用样品均为干燥根部分，着力于阐明竹叶柴胡与北柴胡干燥根在内在成分上的相关性以及竹叶柴胡作为药典正品柴胡的补充资源的可行性。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

不同基源柴胡药材于2011～2013 年期间8 月～9 月采自四川省荣县、绵阳、阿坝州地区、河北承德和陕西凤县，共13 份，编号、基源见表1。供建立标准指纹图谱的北柴胡样品于2011～2013 年期间8 月～9 月采自河北涉县、绵阳青川、河北承德、陕西凤县四川剑阁和河北安国，共10 份，编号、基源见表2。以上样品均由四川省食品药品检验检测院黎跃成主任药师鉴定。

表1 柴胡药材样品Table 1 Information of Bupleurum samples investigated in this study

表2 建立标准指纹图谱的北柴胡药材样品Table 2 Information of B.chinense DC.samples for standard fingerprinting

柴胡皂苷A(批号:110777-201108)、柴胡皂苷D(批号:110778-201208)对照品均来源于中国药品生物制品检定所;柴胡皂苷B2(批号:12041002)、柴胡皂苷C(批号:12091701)对照品来源于通罗马科技有限公司。乙腈，色谱纯，购自Fisher 公司;试剂均为分析纯。

1.2 仪器

Waters2695 高效液相色谱仪-Waters2487 紫外检测器(美国Waters 公司)，Empower 工作站;FB11207 超声处理仪(Fisherbrand);150 摇摆式粉碎机(浙江瑞安永历制药机械有限公司);CPA2250 电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司);SEG-021H高温试验箱(上海爱斯佩克环境设备有限公司)

2 实验方法

2.1 供试品溶液和对照品溶液的制备

分别精密称取适量柴胡皂苷A、B2、C、D 对照品，置10 mL 容量瓶中，用适量甲醇溶解后定容至刻度并摇匀，分别制成浓度为1.04、0.62、0.68 和1.04 mg/mL 的混合对照品溶液。

称取样品粉末(过四号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入含5%浓氨试液的甲醇溶液25 mL，密塞，30 ℃超声处理(功率200 W，频率40 kHz)30 min，滤过，用甲醇20 mL 分2 次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解，转移至5mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 HPLC-UV 分析条件

色谱柱:Welch C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相为乙腈(A)和水(B);梯度洗脱条件为0～50 min，25%～90%A;检测波长为210 nm;柱温35 ℃;流速为0.8 mL/min;进样量为10 μL。

2.3 方法学验证

2.3.1 精密度试验

取2.1 中供试品溶液在2.2 液相色谱条件下，连续进样5 次，测定各共有色谱峰的保留时间和峰面积，以柴胡皂苷D 为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果表明相对保留时间RSD在0.045%～0.98%，相对峰面积的RSD 在0.28%～1.11%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验

取2.1 中供试品溶液分别于制备后0、8、16、24、48 h 进样，测定各共有峰的保留时间和峰面积，以柴胡皂苷D 为参照峰，计算相对保留时间和峰面积的RSD 值，结果表明相对保留时间RSD 为0.056%～1.22%，相对峰面积的RSD 在0.98%～2.65%，说明样品在48h 内稳定。

2.3.3 重复性试验

取S1 样品5 份，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别进样，测定各共有峰的保留时间和峰面积，以柴胡皂苷A 为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积的RSD 值，结果表明相对保留时间RSD 为0.033%～2.01%，相对峰面积的RSD 为1.08%～2.39%，说明该方法重复性良好。

2.4 样品分析

将表1 中18 批柴胡样品按2.1 项下方法制备所得供试液按2.2 项下色谱条件进样分析，记录色谱图，同时定位柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷C 和柴胡皂苷D。

2.5 数据处理

将表2 中10 批北柴胡样品(分别采自陕西凤县、河北涉县、河北承德、绵阳青川和河北安国)HPLC 色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，生成北柴胡对照图谱。再以北柴胡对照图谱为参照图谱，将表1 中13 批柴胡样品HPLC 色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，计算相似度。

以共有峰峰面积为变量，运用SPSS 18.0 软件对各样品进行聚类分析，得出树形图。

3 实验结果

3.1 北柴胡标准指纹图谱的建立

按2.2 项下色谱条件对表2 中北柴胡样品进行检测，记录色谱图50 min 并导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004》，进行色谱峰匹配，匹配数据显示14 个峰是所有样品共有的，按出峰时间依次标定为1～14 号峰。见图1。通过与对照品图谱比较鉴定，第3、6、9 号峰分别为柴胡皂苷C、柴胡皂苷A 和柴胡皂苷D，未检出柴胡皂苷B2，选择6 号峰为参照峰。

图1 北柴胡HPLC 对照指纹图谱Fig.1 HPLC chromatogramofB.chinense

3.2 指纹图谱的相似度计算

按照国家药典委员会公布的中药指纹图谱评价软件计算方法，得到各批次柴胡的HPLC 指纹图谱相似度结果见表2，各批次柴胡样品色谱重叠图见图2。从表2 可知，13 批柴胡样品的相似度均高于0.8，与药典正品北柴胡相比较，不同基源的柴胡均具有较高的相似性。其中8 批栽培竹叶柴胡相似度在0.877～0.925 之间，两批野生品种相似度分别为0.941 和0.932，因此同基源药材由于生长环境不同，指纹图谱相似度也有所差异，野生竹叶柴胡相似度高于栽培竹叶柴胡，10 批竹叶柴胡平均相似度为0.908;马尔康柴胡、马尾柴胡相似度分别为0.915和0.900，说明同为川产道地品种的柴胡与竹叶柴胡化学成分相似度高，基源上较为接近;抱茎柴胡为0.858;

相似度从高到低依次为:竹叶柴胡＞马尔康柴胡＞马尾柴胡＞抱茎柴胡。结果显示，竹叶柴胡与北柴胡化学成分具有较高一致性，并且质量稳定可控。

3.3 聚类分析

根据各色谱峰的峰面积进行系统聚类，结果见图3。由以下树状图可以看出，聚类距离为1 时S12、S13、S1、S10、S11、S8、S9、S6、S7、S5 聚为一类均为竹叶柴胡，S2(马尔康柴胡)、S4(马尾柴胡)在聚类距离为2 时聚为一类，聚类距离为3 时再与S3(抱茎柴胡)聚为一类，聚类距离为4 时与竹叶柴胡聚为一类，说明马尔康柴胡、马尾柴胡、抱茎柴胡与竹叶柴胡基源相近。B9、B10、B4、B6、B7 在聚类距离为1 是聚为一类，均为采自陕西凤县的北柴胡，B1、B8 为采自河北的北柴胡栽培品种，在聚类距离为2 时聚为一类，再与B2、B5、B3 分别在聚类距离为5、7、12 时聚为一类，北柴胡采收地点相差较大，说明不同的生长环境会导致化学成分的差异较大。

表3 柴胡药材样品HPLC 指纹图谱的相似度结果Table 3 Similarities of Bupleurum samples

图2 柴胡药材样品HPLC 色谱重叠图Fig.2 Overlapped HPLC chromatograms of Bupleurum samples

图3 柴胡属植物的聚类树状图Fig.3 Dendrogram of Bupleurum samples

4 讨论

从指纹图谱分析来看，13 批柴胡样品相似度结果均高于0.8，竹叶柴胡样品相似度平均为0.908，说明竹叶柴胡与药典正品北柴胡物质基础相近，且质量可控。竹叶柴胡可作为优质柴胡资源进一步研究，以补充药典收载的品种基源。

聚类分析的结果显示竹叶柴胡聚为一类，马尔康柴胡与马尾柴胡聚为一类，抱茎柴胡聚为一类，以上三种川产柴胡与竹叶柴胡基源最为接近，北柴胡聚为一类。聚类分析与传统基源分类结果一致，因此聚类分析能够对不同基源的柴胡进行分类鉴定。

柴胡属植物种类多，变种、变型多，纷繁复杂，传统基源鉴别主要依赖植物的地上部分形态特征，对于仅使用根部的柴胡药材，鉴别其药材及饮片难度较大。使用HPLC 指纹图谱可全面地得到柴胡药材的皂苷类成分化学信息，并利用这些化学信息可对其进行相似度计算进行有效的质量控制。再结合聚类分方法，可从基源上筛选优质可靠的柴胡品种进行培育，缓解药典正品柴胡供不应求的市场压力。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(国家药典委员会).Pharmacopoeia of People’s Republic of China(中华人民共和国中国药典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I，263-264.

2 Liang ZT(粱之桃)，Qin MJ(秦民坚)，Wang ZT(王峥涛).Study the chemical composition of Bupleurummarginatum Wall.exDC.J Chin Pharm Univ(中国药科大学学报)，2003，34:305-308.

3 Liu YC(刘永春)，Cong PC(丛培臣).The study verview for Chemical composition and pharmacological effects ofBupleurum.J Heilongjiang Med(黑龙江医药)，2006，3:216-218.

4 Xie DH(谢东浩)，Cai BC(蔡宝昌)，An YQ(安益强)，et al.Study progress of chemical constituents and pharmacological effects for Saikosaponin.J Nanjing Univ Trad Chin Med(南京中医药大学学报)，2007，23:63-65.

5 Yang RM(杨润梅)，Gao NN(高南南).Research of the effects of Bupleurumfor four different models of kidney disease.Chin J Mod Med(中国现代实用医学杂志)，2006，5:41-44.

6 Yang ZG(杨志刚)，Chen AQ(陈阿琴)，Sun HX(孙红祥)，et al.Progress of pharmacological effects of Saikosapo-nin.Chin J Veterin Drug(中国兽药杂志)，2005，39:27-30.