羧甲基壳聚糖金属配合物的抗氧化活性研究

冯小强，李小芳，杨 声，陈学喜

1天水师范学院化学工程与技术学院，天水 741001;2 定西师范高等专科学校，定西 743000

氧化和机体的衰老、病变密切相关［1］。天然抗氧化剂因抗氧化效率高，作用时间长，热稳定性好，对人体毒副作用小等特点而成为研究的热点［2］。壳聚糖(简写CS)是一种天然碱性高分子多糖，对人体无毒、可生物降解和多种生物活性，其中抗氧化活性显得尤为重要，但壳聚糖溶解性差这一缺陷在很大程度上限制了它的应用。羧甲基壳聚糖(简写CMC)与CS 相比溶解性好，具有许多独特的性质，且由于羧基基团的引入，使得更容易与多种过渡金属离子配位。研究表明，CMC 具有抗脂质氧化的作用，使兔血清中氧化型低密度脂蛋白及丙二醛含量降低，抑制了脂质的过氧化［3］。当浓度为1.2 mg/mL 时，CMC 对超氧阴离子自由基的清除率达到了13.4%［4］。但就CMC 金属配合物的抗氧化活性的研究却鲜有报道。本实验从清除羟基自由基(·OH)、超氧负离子自由基和总还原能力这三个方面，分别考察了CS、CMC 及CMC 金属配合物的抗氧化活性，并考察了金属离子的含量对配合物抗氧化活性的影响。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

CS、CMC 及配合物用1.0% HAc 溶解，配成浓度为0.1、0.2、0.3、0.4 和0.5 mg/mL 溶液。UV-9200 型分光光度计，北京瑞利仪器有限公司。

1.2 抗氧化活性

2 结果与讨论

2.1 CMC 金属配合物的制备

将6.0 g 壳聚糖、60 mL 异丙醇加入三口烧瓶搅拌均匀，在60 ℃下溶胀2 h。逐滴加入40 mL 9.5 mol/L NaOH，让壳聚糖在碱性条件下形成碱中心，搅拌30 min。将12 g 一氯乙酸用蒸馏水溶解，缓慢滴加到上述体系中。反应4 h 后，调pH 值至中性，抽滤，沉淀依次用70%乙醇、无水乙醇洗涤，干燥得CMC。

称取0.5 g CMC 用蒸馏水溶解，50 ℃搅拌下向其中加入一定量的CuCl2，使得CMC 与Cu2+的物质的量比分别为1∶1、1∶2、2∶1、3∶2、2∶3，或分别加入等摩尔的CoCl2·6H20、AgNO3，反应3 h 后，将沉淀陈化、抽滤、洗涤、干燥，分别得CMC-Cu 配合物(依次记 作CMC-Cu11、CMC-Cu12、CMC-Cu21、CMCCu32 和CMC-Cu23)、CMC-Co 配合物和CMC-Ag 配合物。

2.2 ·OH 的清除实验

·OH 是毒性最大的活性氧，对细胞内DNA 的破坏作用最大，它可以加成至碱基双键中造成碱基破坏，从而产生突变。CMC 金属配合物对羟自由基均具有不同程度的清除效果，并且随着样品质量浓度的增大，对羟自由基清除率逐渐提高，如图1a 所示。相比之下，对·OH 的清除作用从强到弱依次是CMC-Cu11 ＞CMC-Co ＞CMC-Ag ＞CMC ＞CS。当浓度均为0.2 mg/mL 时，不同摩尔配比得到的CMC-Cu 清除·OH 能力存在差异，如图1b 所示，CMC-Cu11 对羟自由基的清除作用最强，CMC-Cu32次之。

图1 CS、CMC、CMC 配合物清除·OH 的能力(a)及Cu2+含量对CMC-Cu 清除·OH 能力的影响(b)Fig.1 ·OH scavenging capacity of CS，CMC and CMC complexes (a)and the effect of Cu2+ on ·OH scavenging capacity of CMC-Cu (b)

CS 可通过三种途径清除羟基自由基［6］;(1)羟基的氢原子与·OH 作用而达到目的;(2)氨基与·OH 反应生成稳定的大分子自由基;(3)氨基先与溶液中的氢作用形成氨正离子，在与·OH 作用形成稳定物质。CMC 中的氨基和羟基被乙羧基取代，是的与·OH 反应的数量减少，但是，乙羧基作为吸电子基团，能降低壳聚糖分子链上的电子云密度，使得分子内、分子间生成氢键的几率降低，故增强了氨基和羟基与·OH 反应的活性。因此，CMC 清除羟自由基的能力强于CS 本身。

2.4 还原能力测定

还原能力是表示抗氧化物质提供电子能力的重要指标，研究表明抗氧化活性和还原能力之间存在着密切的关系。通常采用铁氰化钾法测定700 nm的吸光度，来反映还原能力的强弱。一般吸光度值越大，则还原能力越强。随CMC-Ag、CMC-Cu11、CMC-Co、CMC 和CS 浓度的升高，吸光度值均有所增强，其变化趋势如图3a 所示，说明它们通过提供电子，阻断Fe2+向Fe3+的转变，表现出一定的还原能力。在较高浓度下还原能力从强到弱依次是CMC-Co ＞CMC-Ag ＞CMC-Cu ＞CMC ＞CS。当浓度均为0.2 mg/mL 时，不同摩尔配比的CMC-Cu 还原能力也存在差异，如图3b 所示，CMC-Cu21 的还原能力远远强于其它4 种配合物的还原力。

图2 CS、CMC、CM 配合物清除的能力(a)及Cu2+含量对CMC-Cu 清除的影响(b)Fig.2 scavenging capacity of CS，CMC and CMC complexes (a)and effect of Cu2+ on scavenging capacity of CMC-Cu (b)

图3 CS、CMC、CM 配合物的还原能力(a)及Cu2+含量对CMC-Cu 还原能力的影响(b)Fig.3 Reducing power of CS，CMC and CMC complexes (a)and effect of Cu2+ on reducing power of CMC-Cu (b)

2.5 讨论

CMC 分子中存在大量N-H、O-H 和-COOH 基团，它们能与自由基发生反应，故对自由基有一定的清除能力。另外过渡金属的d 轨道电子较活泼，且有缺电子的空轨道，因此过渡金属易得失电子，金属离子可与自由基发生反应，在自由基氧化过程中起催化剂作用，表现出一定的抗氧化活性。实验结果发现，CMC 金属配合物的抗氧化活性强于CMC 和CS 本身，可能是由于羧基参与配位使配合物的构型发生改变，金属离子和CMC 的协同作用所致。

3 结论

CMC-Ag、CMC-Cu 和CMC-Co 均具有很好的抗氧化能力，抗氧化性随浓度的增加而增强，且与配合物中金属离子的含量有关。该研究为壳聚糖衍生物的开发、为寻找天然抗氧化剂提供了新的思路。

1 Brawn K，Fridovich I.DNA strand scission by enzymically generated oxygen radicals.Arch Biochem Biophys，1981，206:414-419.

2 Ye WC，Fan CL，Zhang LH，et al.A new phenolic glycoside from the roots ofLygodium japonicum.Phytochem Commun，2007，78:600-601.

3 Lin YW(林友文)，Lin Q(林青)，Zheng JF(郑景峰)，et al.Studies on reducing the plasma lipid and antioxidation of carboxymethyl chitosan in rabbits.Chin J Mar Drugs(中国海洋药物)，2003，22(3):16-19.

4 Sun T，Xie WM，Xu PX.Superoxide anion scavenging activity of graft chitosan derivatives.Carbohydr Poly，2004，58:379-382.

5 Feng XQ (冯小强)，Li XF(李小芳)，Yang S(杨声)，et al.Optimization of extraction process of antioxidant components from orange peel and determination of its antioxidant activity.Hunan Agric Sci(湖南农业科学)，2012，21:86-88.

6 Xie WM，Xu PX，Liu Q.Antioxidant activity of water-soluble chitosan derivatives.Bioorg Med Chem Lett，2001，11:1699-1701.