宫颈癌组织HPV16早期基因E6相关转录本检测方法的建立及意义

卢徐涟，邹阮敏，陈向敏，陈俊，张丽芳，薛向阳

（1.温州医科大学 微生物学与免疫学教研室、分子病毒与免疫研究所，浙江 温州 325035；2.温州医科大学附属第一医院 妇产科，浙江 温州 325000；3.温州医科大学 检验医学院、生命科学学院，浙江 温州 325035）

宫颈癌是在全世界引起女性死亡的第二大癌症。高危型HPV（high-risk human papillomavirus，HR-HPV）的持续性感染，尤其是HPV16和HPV18，是引起宫颈癌的重要病因[1]。目前已明确HPV早期癌蛋白E6、E7与抑癌基因p53和pRb之间的E6-p53、E7-pRb调控模式在宫颈上皮细胞癌变过程中起着重要作用[2-3]；此外，E6、E7的表达还可引起宿主基因组的不稳定[4]。HPV基因属于双顺反子或多顺反子，常存在转录后RNA剪切的过程，以消除转录本中非编码的内含子序列[5]。不同的RNA剪切方式可形成不同的转录模式，由此产生差异的编码蛋白。另外，已证实宫颈细胞癌变过程中常存在HPV基因整合，而整合于宿主基因组的病毒基因由于受转录和转录后水平调控的影响，会明显改变病毒基因的表达。目前HPV E6基因转录的检测主要通过普通PCR或Real-time RCR扩增，但是这些方法不能明确E6基因的完整转录本，为此，本研究旨在建立HPV16早期基因E6相关转录本检测方法，以分析宫颈癌不同病变时期HPV16 E6相关转录模式的变化。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 宫颈标本：留取温州医科大学附属第一医院从2010年12月到2012年4月间妇科63例HPV16阳性宫颈肿瘤患者术后组织样本和9例正常宫颈组织，患者年龄25～59岁，平均（42±0.75）岁。根据TBS诊断系统，63例肿瘤样本中，低度鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）8例、高度鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）38例和宫颈癌17例。所有患者在术前均未进行放疗、化疗等治疗，且均经阴道镜检查。本研究使用的临床样本已经由患者知情以及医院伦理委员会同意。每例标本离体后10 min内放入RNAlater并置于液氮中保存待后续实验。

1.1.2 实验试剂：RNAlater购于美国Ambion公司；Trizol试剂购于美国Invitrogen公司；Rnase-free Dnase I试剂盒购于大连Takara公司；RT-PCR试剂盒和KOD plus PCR试剂盒购于日本TOYOBO公司；硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜购自美国Bio-Rad公司；Southern检测试剂盒（North2South Chemiluminescent Detection Kits）购自美国Thermo公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于北京天根生物科技有限公司；HPV16 E6特异性寡核苷酸探针及引物在上海生物工程有限公司合成。

1.1.3 细胞株：Caski细胞（人宫颈癌HPV16阳性），购于中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 方法

1.2.1 Caski细胞培养：人宫颈癌Caski细胞接种于含10%胎牛血清的1640培养基中，于37 ℃、5%湿度及体积分数5% CO2条件下培养、传代，每2～3 d传代一次。

1.2.2 总RNA提取：取液氮保存的宫颈组织样本，在液氮中碾碎至粉状，按照Trizol试剂的说明书分离RNA。为了防止残余DNA污染，按DNA消化试剂盒说明书去除DNA。提纯后的RNA溶解在Rnase-free水中，并保存在-80 ℃环境中。用分光光度仪（德国EPPENDORF公司）检测RNA溶液在紫外光波长为260 nm与280 nm的OD值，计算RNA的浓度和纯度，同时用1%琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性。

1.2.3 RNA反转录以及HPV16 E6相关转录本的扩增：将1μg总RNA以RT引物（GACTCGAGTCGACATCGAT TTTTTTTTTTTTTTTT）进行反转录[6]。反应体系为20 μL，包括1μg RNA、1μL 50μmol/L RT、1μL Enzyme mix、4μL 5×buffer Nuclease free water。反应条件为：65 ℃，10 min打开RNA茎环结构，接着加入反应缓冲液和反转录酶，42 ℃，60 min，95 ℃，5 min，产物cDNA保存于-20 ℃环境。然后以cDNA为模板，用HPV16 E6特异性引物P1（CGACC CAGAAAGTTACCAC）和P0（GACTCGAGTCGACATCGA）作为PCR的前向、反向引物，采用50μL反应体系扩增HPV16 E6转录本。反应体系包括1.0 mmol/L MgSO4，0.2 mmol/L dNTPs， 0.2μmol/L前、反向引物和1.0单位高保真酶（KOD plus）。反应条件为：95 ℃，90 s预变性，94 ℃，30 s变性，59 ℃，30 s退火，68 ℃，2 min延伸，35个循环，68 ℃，6 min最终延伸，保证扩增片段的完整性。PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.4 Southern Blotting技术检测：取5μL PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳分离后，通过湿转的方法将凝胶中的DNA充分转移到NC膜上，80 ℃干燥2 h固定，加入适当的杂交液（以10 cm2膜面积加入1 mL杂交液），预杂交1 h，弃去，更换同体积的杂交液，同时加入HPV16 E6特异性寡核苷酸探针（终浓度10μmol/L）46 ℃杂交过夜（12～15 h）。杂交后，弃去杂交液加入50 ℃预热的等体积高盐离子浓度漂洗液（包含2×SSC和0.1% SDS），50 ℃震荡漂洗20 min，重复一次。然后再用低盐离子浓度漂洗液（包含0.2×SSC和0.1% SDS），53 ℃震荡漂洗15 min，重复一次。接着按照North2South Chemiluminescent Detection Kits说明书的操作步骤标记探针与酶促发光，最后用胶片曝光。

2 结果

2.1 HPV16 E6早期基因转录本特异性扩增方法的建立 图1是既往报道的HPV16 E6相关转录模式。由于宫颈癌发生过程常存在HPV基因整合，为分析HPV16 E6转录本，本研究利用含保守序列的RT引物将组织标本中的mRNA反转录成5’端含保守序列的cDNA，并利用HPV16 E6特异性引物（P1）和保守序列（P0）进行PCR扩增，以达到扩增和克隆cDNA分子中的一个短序列及其未知的3’末端之间的区域[7]。这种设计不但可扩增游离型HPV16的E6转录本，而且可有效扩增整合型E6转录本。如图2所示，HPV16阳性的Caski宫颈癌细胞及正常宫颈组织经本方法扩增后，Caski细胞标本琼脂糖电泳能检测到目的条带（见图2A），而正常宫颈组织样本未见扩增条带（见图2B），提示本方法能特异性扩增HPV16 E6相关转录本。

图1 HPV16 E6相关的转录模式

图2 HPV16 E6早期基因转录本特异性扩增方法特异性分析

2.2 宫颈癌发生发展不同阶段HPV16 E6转录模式的差异分析 基于上述建立的方法，本研究系统分析HPV16阳性的LSIL、HSIL及宫颈癌组织中HPV16 E6的转录模式。如图3所示，在LSIL样本中，只检测到少量的转录片段，常见的转录片段长度为250、500和1 000 bp，在HSIL样本中，转录片段数量和种类明显多于LSIL，主要的片段长度集中在250、650和1 000 bp以上的大片段，而在宫颈癌组织中，除转录片段的数量和种类增多以外，优势转录片段更加明显，主要集中在500和1 000 bp。随着LSIL向宫颈癌发展，HPV16 E6转录本片段种类增多，而且优势转录模式逐渐清晰。Southern Blotting进一步证实了HPV16 E6转录模式在宫颈癌发生发展不同阶段中的变化（见图3）。另外，由于部分转录片段数量少，荧光杂交信号太弱，少量非特异性扩增不在探针序列的检测范围等原因，导致这些转录本在Southern Blotting技术检测中无法显示，如宫颈癌组织第5泳道的转录片段。

图3 APOT法分析LSIL、HSIL和宫颈癌组织中HPV16 E6相关的转录模式

3 讨论

HPV基因组是长度约7.9 kb双链环状DNA，可分为非编码区LCR（long control region），早期基因区（编码E1、E2、E4、E5、E6及E7 6个早期基因）和晚期基因区（编码衣壳蛋白L1和L2）[5]。由于HPV基因组具多顺反子特征，不同转录模式以及转录本的不同剪切模式常导致不同HPV基因表达[5]。此外，由于E6蛋白的稳定性不高，目前普遍使用的蛋白实验手段几乎检测不到。因此，要了解E6基因的表达只能基于基因的转录水平。

目前检测HPV E6基因表达常根据E6序列设计引物进行RT-PCR或定量PCR检测。这种检测的缺陷在于仅检测引物部分序列，无法明确E6相关转录本信息。理论上，采用Northern Blotting杂交检测可弥补这种缺陷，但宫颈癌组织中E6相关转录本含量较少，限制其使用。本研究建立的方法是先对E6相关转录本进行PCR扩增后，再进行特异探针杂交，可极大提高检测敏感性。目前也有不少研究者采用APOT的方法检测游离型和整合型的病毒癌基因转录模式[8-10]，但这种两轮扩增的巢式PCR的检测方法存在一定局限。比如，它无法有效扩增由病毒基因和整合基因构成的融合型长序列的转录本，因此检测到的整合型转录本数量少于实际存在的数量[10]；另外，这种PCR检测方法会倾向于扩增实际mRNA浓度高转录本数量多的转录模式而忽略较少数量的转录模式。因此，我们通过优化检测方法削弱高含量转录本的扩增优势，使检测结果更客观，同时，将两轮PCR改成一轮，比原有的方法更方便简洁。

尽管HPV16游离型感染的基因转录模式已经阐明[5]，但在宫颈癌发生发展过程中HPV基因组常整合入宿主细胞基因组，可改变HPV基因的转录模式[6]。既往的研究主要集中在E7相关转录模式的变化，在HPV16阳性的宫颈癌组织中发现了游离型的E7-E1^E4和整合型的E7-E1^cellular DNA、E7-E1^E4-cellular DNA等多种E7相关的转录模式[6，11]。关于E6相关的转录，已经证实，除外E6全长基因转录模式，HPV 16还可编码E6*I和E6*II两种E6相关转录本[5]。这两种转录本均以E6 ORF中226位点作为剪切供体，但分别以HPV16基因组中409和526位点作为剪切受体位点。有研究提示，这两种转录模式与促进E7表达有关[12-13]。在宫颈癌组织HPV16 E6的转录模式，目前也发现E6-E7-E1[9]、E6-E7-E1^E4、E6-E7-E1（E1完整）、E6-E7-E1（E1不完整）整合型的模式和E6-E7-E1^E4游离型的模式[9，11]，但HPV16 E6相关转录本与宫颈癌发生发展的相关性鲜见报道。

为分析宫颈癌发生不同阶段的HPV16 E6相关的转录情况，本研究参考检测E7相关转录本的APOT方法[6]，建立了特异性扩增HPV16 E6相关转录本的方法。这种设计能有效扩增直接poly A结尾的E6相关转录本，不但可用于检测游离型HPV16的E6转录本，而且可有效检测整合型E6转录本[9，11]。琼脂糖凝胶电泳及Southern Blotting证实，我们建立的方法能有效检测HPV16 E6相关转录本。

基于建立的HPV16 E6相关转录本检测方法，我们检测了63例HPV16阳性的宫颈病变组织（包括8例LSIL、38例HSIL及17例宫颈癌组织标本）中E6相关的转录模式。结果发现，随着LSIL向宫颈癌发展，HPV16 E6转录本片段种类增多。但在所检测的标本中都无法检测到所有既往报道的转录模式。Van Tine等[14]认为，转录模式的选择是一个动态的过程以应对变化的环境，从而达到最优的基因表达模式使细胞增殖，这也许容易理解随着细胞癌变程度的加深优势转录模式逐渐清晰的原因。另外，基因转录后的可变剪切使病毒癌性基因的转录模式向着有利于肿瘤细胞增殖的方向发展也是导致转录模式在不同病变组织中存在差异的重要原因[5，12，15]。

HPV16早期基因转录模式在宫颈癌发生发展过程中的作用鲜见相关研究报道。目前已报道的检测HPV的方法[16-21]敏感度不高，检测引物的特异性有待增强[22]。本研究发现，HPV16早期基因转录模式在宫颈癌变各时期中存在很大差异，这为宫颈癌早期诊断治疗和判断预后提供了新思路。

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