唐古特大黄种子灌浆充实动态及发芽特性研究

曹师，郭凤霞＊，陈垣，杨育峰，郭爱伟

（1．甘肃农业大学甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室 甘肃省中药材规范化生产技术创新重点实验室 生命科学技术学院，甘肃 兰州730070；2．卓尼县佛赐藏药材开发有限责任公司，甘肃 甘南州747000；3．兰州商学院长青学院，甘肃 兰州730020）

唐古特大黄（Rheumtanguticum）为蓼科（Polygonaceae）大黄属（Rheum）草本植物［1］，其与掌叶大黄（Rheumpalmatum）或药用大黄（Rheumofficinale）均为大黄药材的主要植物，主要分布在甘肃、青海及青海与西藏交界一带，生于海拔1700～4300m高山沟谷、灌丛及半阴坡石堆中［2］，是中国特有种。大黄以干燥的根和根茎入药，性味苦，寒。归脾、胃、大肠、肝、心包经，具泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄等功效［3］。甘肃陇南礼县一带主要种植掌叶大黄，甘南州一带主要种植唐古特大黄。唐古特大黄是常用的中藏药，而且已成为众多功能性保健品及特色食品的主要原料。

然而，唐古特大黄的药源主要来自野生品，随着药用范围的扩大，过度采挖已导致野生资源日益减少，又得不到有效保护，野生品已几近枯竭［4］，成为市场紧缺的名贵中药材，市场供不应求，因此，发展人工种植是保护其野生资源的有效途径。唐古特大黄依赖种子繁殖，种子质量直接影响药材栽培的成效。肖苏萍等［5］初步研究表明，大黄3个种的果实外观形态和种子的物理特性指标都存在差异，青海野生唐古特大黄翅与果脐呈褐色，种子黑色，翅无皱缩，种子发芽率为48%～53%。杨君丽等［4］发现，唐古特大黄种子经超声波处理后发芽率和发芽势分别较对照提高8%和19%，高压静电处理后分别较对照提高17%和15%，50mg／kg的赤霉素处理后分别较对照高出16%和12%。张世玺［6］在田间试验基础上，总结出唐古特大黄规范化种植技术规程和主要病虫害防治方法。徐文华等［7］研究发现唐古特大黄无菌苗各部位均可作为离体培养的良好外植体，下胚轴适宜分化诱导，子叶适宜愈伤组织诱导，并总结出适宜分化、生根和愈伤组织的培养基。以上研究对探寻唐古特大黄人工栽培关键技术和繁殖奠定了良好基础。然而，目前尚无唐古特大黄种子采收标准，采收的种子成熟度参差不齐，严重影响田间出苗率和育苗成效。国内外对禾谷类作物种子灌浆与产量关系有较为深入的研究，干热条件下种子灌浆速率高而持续期短的小麦（Triticumaestivum）品种产量高［8－9］。高蛋白大豆（Glycinemax）品系在灌浆期间维持每粒种子的最大同化吸收。近年来也涉及一些药用植物种子灌浆特性的研究。研究［10－15］表明，红花（Carthamus tinctorius）种子产量和种子油产量均与种子灌浆速率有关。种子灌浆成熟程度与种子发芽质量有密切关系，成熟优质掌叶大黄种子含水量在10%及以下。但至今对唐古特大黄种子灌浆充实规律及其种子发育过程中发芽质量动态变化的研究尚未见相关报道，而且随着中药资源产业化和现代化的发展，大规模育苗栽培成为中药材规范化生产基地（Good Agriculture Practices，GAP）建设中的重要内容。因此，研究唐古特大黄种子灌浆动态及与发芽质量的内在联系，探寻其种子最佳采收期具有重要意义，可为其GAP基地建设中确立其种子适宜采收标准提供科学依据。

1 材料与方法

1．1 试验材料及试验区概况

试验材料为甘肃省甘南州卓尼县扎古录镇卓尼县佛赐藏药材开发有限责任公司示范园区。试验地海拔2785m，属高寒、高海拔地带。

1．2 种子灌浆动态测定

2012年6月1日，随机选取唐古特大黄盛花期植株，选择当天开花的花序挂牌标记，剪除顶部花蕾，预留基部发育一致的花朵。从6月10日开始，每天定时（下午14：00）取样，每隔3d采收1次种子。每次采收10个果序，剥出小瘦果种子，随机数取100粒种子立即称其鲜重，重复3次，然后装入与采收期对应编号的牛皮纸袋中，置通风干燥处晾晒后封口保存。待灌浆测定结束后，将种子统一带回甘肃农业大学中草药栽培与鉴定实验室，80℃烘至恒重（12h），称其干重，最后按公式［11－15］计算灌浆参数。其余种子均按采收期编号置于已编号对应另1组牛皮纸袋中，自然风干后保存备用于平行发芽试验。

阶段灌浆速率（stage filling rate，SFR，g／d·100种子）＝（后次百粒干重－前次百粒干重）／2次取样间隔天数

平均灌浆速率（the average filling rate，AFR，g／d·100种子）＝开花后某天百粒干重／开花后天数

含水量（water content，%）＝100×（百粒鲜重－百粒干重）／百粒鲜重

脱水速率（dehydrate rate，DR，%／d）＝（前次含水量－后次含水量）／2次取样相隔天数

1．3 种子发芽试验

以上述备用于发芽的不同采收期种子为材料设计发芽试验，在不同采收期的唐古特大黄种子中，分别随机选取大小和饱满度均一的种子各150粒，随机分为3组，每组50粒（3次重复），分别置于对应编号的培养皿中，加入10mL灭菌蒸馏水浸种12h后，用灭菌蒸馏水冲洗3次，然后将其均匀摆放在铺有2层滤纸的已灭菌对应编号的培养皿（直径10cm）中，放置于25人工气候箱（RXZ型，宁波）中。24h后开始统计发芽种子数，种子连续5 d不再发芽确定为发芽结束。最后参照农作物种子检验规程［16］计算各发芽指标。

发芽率（germination rate，%）＝已发芽种子数×100／供试种子总数

发芽势（germination power，%）＝日发芽种子数达到最高峰发芽种子数×100／供试种子总数

发芽指数（germination index，GI）＝∑（当天的发芽种子数Gt／对应的发芽天数Dt）

1．4 数据分析

采用SPSS软件对试验数据进行方差分析和相关分析，作图采用Excel 2003统计软件。首先根据郭凤霞等［13］Excel作图法利用散点图对种子百粒干重（Y）随开花后天数（X）拟合Logistic曲线方程，开花后天数范围为花后10～58d，百粒干重为该时期每隔3d采收百粒种子的测定值，每次为重复3次测定结果的平均值，共采收17次。然后用曲线方程可直线化方法［14］求出方程各参数，最后利用方程参数估算灌浆次级参数［11－15］。

2 结果与分析

2．1 唐古特大黄种子灌浆充实过程中种子百粒重的变化动态

大田观察表明，4年生唐古特大黄在甘肃省卓尼县扎古录镇5月上旬开始抽薹，5月中旬开始现蕾，5月下旬进入初花期，6月初进入盛花期，6月中上旬陆续进入结果期，7月中下旬花期开始结束，种子进入灌浆充实期，7月底种子陆续开始成熟，至8月中上旬种子全部成熟，小瘦果果柄开始形成离层从种株上脱落。

本研究从6月1日（盛花期）挂牌标记开花一致的唐古特大黄花序，于6月10日（开花后第10天）开始测定其种子百粒重的变化动态。测定结果表明（图1），唐古特大黄单果种子从形成小瘦果开始到种子成熟其种子百粒鲜重经历了快增期、缓增期、下降期和稳定期4个阶段，灌浆过程持续60d左右。开花13d前，种子鲜重和干重均缓慢增加，花后13～19d种子百粒鲜重显著增加（F＝15．4986，P＜0．05），花后19～31d，百粒鲜重稳定增长并在花后第31天左右达到最大值（3．2307g），随后因种子脱水加快，种子鲜重极显著迅速下降（F＝793．25，P＜0．01），种子干物质持续积累，至灌浆终期种子鲜重（1．1787g）接近干重（1．0687g）的水平，但两者间的差异性仍达到显著水平（t＝4．2489，P＜0．05）（图1）。在整个种子灌浆过程中，开花后10～58d期间种子百粒鲜重的变化范围为1．1787～3．2307g，变异系数27．61%；百粒干重的变化范围为0．2657～1．0950g，变异系数42．88%，显然百粒干重变异大，即在整个种子灌浆过程中，种子干物质积累量的动态变化幅度较大。

随着开花天数的延长，唐古特大黄种子百粒干重呈“S”型变化趋势（图1），开花后种子的百粒干重极显著增加（F＝880．7883，P＜0．01），并在花后第49天达到最大值（1．0950g），较百粒鲜重最大值出现的时间延后19d左右，之后随灌浆持续时间的延长，种子在株上进一步完熟发育，种子百粒鲜重继续下降，种子百粒干重虽也有所下降，但在花后49～58d期间其下降程度未达到显著水平（F＝0．6448，P＞0．05），种子百粒干重基本稳定在1．0838g左右的水平。

图1 唐古特大黄种子灌浆成熟过程中百粒重的变化Fig．1 Changes of 100－seed weight including fresh weight（FW）and dry weight（DW）in R． tanguticumplant

图2 唐古特大黄百粒干重积累与开花后天数配合Logistic方程直线化拟合结果Fig．2 Linear result based on Logistic equation fitting dry weight of 100－seeds with filling duration in R． tanguticumplant

对种子百粒干重随开花后天数的变化趋势配合Logistic曲线方程，拟合结果及估算的灌浆各参数（图2和表1）显示，种子百粒干重积累动态符合Logistic曲线方程Y＝1．1529／1＋e2．4757－0．0967X，拟合指数极显著（R2＝0．9611，P＜0．01），其中百粒干重极大值K为1．1529g，方程截距A为初始百粒干重转换值，方程回归系数B可反映出干物质积累速率。估算灌浆参数（表1）显示，开花后种子成形后灌浆充实启动，干物质逐渐积累，这一时期为渐增期，持续12d左右。开花后12～39d期间干物质积累速度加快，灌浆进入快增高峰期，此期间种子鲜重迅速增大并达到最大值，干重持续快速增加，花后26d左右即Logistic曲线拐点，即方程直线化后与x轴的交点处籽粒干物质积累速度最快（图2）。开花36d后种子灌浆进入缓增期，种子干重缓慢积累，鲜重迅速下降，这与百粒重的变化趋势基本相一致，至开花后58d单果种子已完全成熟，灌浆基本结束，说明单花灌浆持续期为58d左右，Logistic曲线方程估测的理论灌浆终期在花后73d，两者相差15d。

2．2 唐古特大黄种子灌浆速率及平均灌浆速率的变化

唐古特大黄种子灌浆过程中灌浆速率呈波动变化规律（图3）。从种子形成开始到花后28d，阶段性灌浆速率呈波动上升趋势，花后第22天左右出现灌浆低峰，接着迅速回升，于花后第28天左右阶段性灌浆速率达到最大值（0．0457g／d），平均灌浆速率也处在开花10d后的最高水平，这与logistic方程估测的达到最大灌浆速率的时期即花后26d基本相一致（图2和表1），之后灌浆速率迅速波动下降并在花后第37天出现一次低峰，而在此阶段阴雨天气较多，接着又逐渐回升，到花后第46天又一次出现高峰，之后开始持续下降，花后第52天开始，种子灌浆充实过程基本结束，阶段性灌浆速率基本为零。在整个种子灌浆过程中，花后10～58d期间种子平均灌浆速率经历先平稳下降然后平稳上升再平稳下降的动态变化趋势，在开花后第28天左右达到较高水平，之后持续下降，灌浆末期维持在一个相对稳定的水平。

2．3 唐古特大黄种子灌浆过程中种子含水量及脱水速率的变化动态

唐古特大黄种子在灌浆充实期间，种子成形后开始持续脱水，种子含水量持续下降，其脱水速率随灌浆进程的递进呈先上升后下降的变化趋势（图4），从花后10d至49d期间种子脱水速率随灌浆持续时间的延长波动上升并达到最大值，开花49d后种子脱水速率迅速下降，种子含水量则一直呈降低趋势。至开花13d左右种子含水量达最高（88．79%），这与Logistic估计的干物质积累高峰起始时间（花后第12天）基本吻合（表1），之后随着籽粒脱水速率的加快，含水量逐渐下降。花后第43天后随脱水速率的加快，种子含水量急剧下降（图4），此时种子干物质积累已进入缓增期（表1和图1），花后第49天左右种子脱水速度最快（图4），此时种子干物质积累已进入平稳期（表1和图1），花后第55天后种子含水量下降至10%以下。整个种子灌浆过程中，种子含水量变化范围为88．79%～9．32%，变异系数42．95%。

表1 唐古特大黄百粒干重积累与开花后天数配合Logistic方程估计的灌浆参数Table 1 Estimation of filling parameters based on Logistic equation fitting dry weight of 100－seeds with filling duration in R． tanguticum

图3 唐古特大黄种子阶段性灌浆速率和平均灌浆速率的动态变化Fig．3 Dynamic changes of the stage filling rate and the average filling rate in 100－seeds of R． tanguticumplant

图4 唐古特大黄种子灌浆充实过程中含水量和脱水速率的变化动态Fig．4 Dynamic changes of water content（WC）and dehydrate rate（DR）in thousand seeds of R． tanguticumplant

2．4 灌浆过程中不同时期采收种子的发芽质量指标变化动态

在唐古特大黄种子整个灌浆过程中，不同时期采收的种子其终发芽率、发芽指数和发芽势等发芽质量指标均存在极显著差异（表2）。开花19d前采收的种子均不具备萌发能力，开花20d后采收的种子才开始具发芽能力。发芽过程中，种子从着床后第7天开始萌发，第17天发芽结束，以发芽第10天的种子发芽率作为发芽势指标。图5显示，随着灌浆持续时间的延长，采收种子的发芽率、发芽势、发芽指数均显著提高，开花后第34天采收的种子发芽率达到最大值（84．0%），之后发芽率维持在最大值附近波动变化，且变化不显著（P＞0．05）。灌浆过程中种子发芽势和发芽指数的动态变化趋势大致相同，与发芽率相比较，发芽势和发芽指数最大值出现在花后第49天，较发芽率最大值出现的时间延后6d左右，之后随着种子在植株上进一步生长发育，种子的发芽率、发芽势和发芽指数又都开始出现下降趋势，但在49～52d期间发芽率、发芽势和发芽指数等发芽质量指标的下降均不显著（t＝0．1492，P＞0．05；t＝0．2822，P＞0．05；t＝0．092，P＞0．05）。

表2 种子灌浆期间不同时期采收种子各发芽指标的方差分析Table 2 Variance analysis of germination indicators for seeds harvested in different time during filling stage

图5 唐古特大黄籽粒灌浆成熟过程中发芽特性的变化动态Fig．5 Dynamic trend of germination traits of R． tanguticumplant seeds in seed filling process

开花后10～52d期间灌浆及发芽指标相关分析表明（表3），种子干重积累量与灌浆持续期和种子脱水速率均呈极显著正相关（P＜0．01），与种子发芽质量各指标也均呈极显著正相关（P＜0．01），但与种子含水量呈极显著负相关（P＜0．01），与灌浆速率相关性不大（P＞0．05）。种子百粒鲜重与种子含水量呈极显著正相关（P＜0．01），与脱水速率呈极显著负相关（P＜0．01），而与种子灌浆和发芽质量指标间的相关性均不显著（P＞0．05）。种子发芽质量各指标均与灌浆持续期呈极显著正相关（P＜0．01）外，与种子脱水速率也呈极显著正相关（P＜0．01），而与种子含水量呈显著负相关（P＜0．05）。种子发芽质量指标间均呈极显著正相关（P＜0．01）。

3 讨论与结论

灌浆期是指种子从开花到生理成熟这一持续的生理过程，超过这一时期籽粒营养成分的积累无明显增加。种子的百粒重可反映种子的大小，也是构成种子产量的重要因素［18］，然而种子的百粒重的高低是由灌浆速率和灌浆持续时间决定的［19］。作物籽粒生长所需的80%～90%的碳水化合物都是来自开花后的同化产物，只有10%～20%来自原有储备［20］。在地中海环境条件下，红花品种的灌浆速率随基因型的不同而异，57%以上种子产量的变化是由种子灌浆速率的变化造成的。提高灌浆速率可改善种子干物质组分，获得较高收获指数。选育灌浆速率高的品种是提高红花产量的可行策略。因此，了解灌浆速率和灌浆持续期可以更好地掌握作物的生长发育状态。本研究结果表明，在甘肃省甘南州卓尼县栽培4年的唐古特大黄单花灌浆持续期58d左右，这与栽培3年的掌叶大黄种株［21］和栽培5年的麻花秦艽（Gentianastraminea）种株［22］单花种子灌浆持续期基本相一致，不同的是Logistic曲线方程估测的唐古特大黄灌浆终期极限在花后73d，与实际相差15d左右，而估测的掌叶大黄灌浆期极值为61d，麻花秦艽灌浆期极值为60d，说明若水肥条件和气候适宜，唐古特大黄种子库容可能增大，灌浆充实持续期可能会延长，这也从唐古特大黄种子灌浆过程中种子百粒干重实际出现的最大值1．0950g与方程估测的极大值1．1529g的差异性反映出来。唐古特大黄种子在成熟过程中，百粒鲜重经历了快增、稳增、下降和稳定4个阶段，即百粒鲜重从开花后持续增加并在花后31d达到最大值，随后迅速下降到接近干重的水平。开花后10～58d种子灌浆过程中，百粒干重的变化趋势呈“S”型曲线，符合Logistic曲线方程，即开花后种子的百粒干重从缓慢增加到持续极显著增加，并在花后第49天达到最大值（1．0950g），较百粒鲜重最大值出现的时间延后19d左右，之后随灌浆持续时间的延长，种子在株上进一步完熟发育，种子百粒鲜重继续下降，百粒干重虽在开花49d后也有所下降，但下降程度不显著，最后种子百粒干重基本稳定在1．0838g左右。在整个灌浆期间，种子脱水速率随灌浆进程的递进呈先快后慢的趋势，种子含水量则持续下降，种子干重持续增加，至开花后55d种子干重趋于稳定，百粒干重在花后第49天达到最大1．095g，但含水量仍维持较高水平36．76%，开花52d后种子干重呈逐渐下降趋势，至花后58d百粒干重达1．0687g，种子含水量下降至9．32%，种子含水量下降最快的时期为灌浆高峰结束期。以上结果说明唐古特大黄种子灌浆过程中，种子脱水速率的加快和干物质积累的稳定是种子成熟的重要标志，种子的最佳采收期应该在7月下旬，种子含水量在10%及以下为宜。

表3 唐古特大黄种子灌浆特性与发芽特性的相关分析Table 3 Relationship analysis of filling characteristics to germination trait of R． tanguticumplant seeds

种子的质量直接影响其田间出苗率，进而影响药材的产量和质量，而种子发芽率、发芽势和发芽指数是衡量种子质量的关键性指标，因此中药材种植应该从种子质量的源头抓起，才能更好地保障药材的质量和产量［12］。石有太等［11］和米永伟等［22］研究表明，甘肃礼县栽培3年的掌叶大黄种子灌浆充实过程中，开花36d后种子已具较高的发芽能力，种子内淀粉含量、可溶性糖含量和蛋白质含量均已稳定达到较高水平，但种子含水量较高，开花56d后种子含水量才下降到10%左右。本研究表明，在开花19d内采收的唐古特大黄种子可能由于其干物质积累量不足以满足萌发过程中所需的能量，种子尚不具备萌发能力，花后第22天以后采收的种子随灌浆持续期的延长种子的发芽势、发芽率和发芽指数等发芽质量指标显著提高，在花后第49天（7月19日）及以后采收的种子其发芽势、发芽率和发芽指数均达到相对稳定高的水平，开花55d后种子含水量下降至10%以下。相关分析表明，种子百粒干重和灌浆持续期均与种子的发芽率、发芽势和发芽指数呈极显著正相关，而种子含水量与发芽质量各指标间均呈极显著负相关，这与对掌叶大黄［21］和麻花秦艽［22］的研究结果相一致。大田观察到灌浆末期唐古特大黄叶片与茎秆渐变黄时种子已成熟，此时种子含水率为10%左右，为适宜采收期，即开花55d（7月底）后茎秆尚未枯萎时采收为宜，由于株间和同株种子成熟均不一致，采收时需分批次及时采收，严防种子脱落损失。

致谢：甘南州科技局甘玉伟提供合作，甘肃农业大学硕士研究生齐浩参与田间试验工作，2011级硕士研究生孙云波、农学院中草药栽培与鉴定专业本科生陈宏观、张万世、何志鹏、陈高峰等参与部分实验室试验。

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