紫花苜蓿QTL与全基因组选择研究进展及其应用

康俊梅，张铁军，王梦颖，张怡，杨青川

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193）

＊紫花苜蓿（Medicagosativa）是世界上分布最广，种植面积最大的饲草作物品种。由于其适应性强、产草量高、营养价值丰富，且具有生物固氮等优良特点，已在世界范围内被广泛种植，种植面积达32×106hm2［1］。在美国，苜蓿已被作为第三大作物，仅次于玉米（Zeamays）、大豆（Glycinemax），种植面积大约800万hm2［2］。在我国，近几年苜蓿种植面积不断增加，大约为300万hm2，居世界第6位，而且种植面积还有不断扩大的势头。紫花苜蓿是同源四倍体，异花授粉植物，由于其自交衰退的特点，使其遗传改良与二倍体作物相比更为复杂。尽管国内外苜蓿育成品种取得较大的发展，但这些品种的选育方法都是通过传统的育种手段。传统的育种方法选育周期长，一般需要5～7年，而且需要消耗大量的人力、物力，进行大面积的田间表型选择。随着现代分子标记技术的快速发展，分子标记辅助育种技术开始兴起，并不断成为分子育种中最重要的育种技术之一［3－4］。该技术是利用分子遗传标记，借助于目标基因紧密连锁的遗传标记的基因型分析，鉴定分离群体中含有目标基因的个体，从而提高了选择效率，减少了选择的盲目性，可极大提高传统育种的选择效率，加速育种进程［5－6］。特别是对抗性基因的筛选，可以脱离传统育种情况下所必需的选育环境。因此，开展苜蓿遗传图谱构建与QTL定位研究，对加速苜蓿遗传改良与新品种选育具有重要的意义。本文综述了苜蓿遗传图谱构建与特征，QTL定位及发展趋势，并对关联作图与全基因组选择等方面的研究进展加以概括。以便读者对本领域有较全面的了解，并为分子标记辅助育种技术在苜蓿遗传改良中的应用提供理论依据。

1 分子标记的发展及其应用

最早应用分子标记的是Botstein等［5］利用限制性内切酶片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）构建了人类遗传连锁图谱，从而奠定了分子标记技术研究的基础，此后分子标记技术发展迅速，先后有随机扩增多态性DNA（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）、简单重复序列间扩增（inter－simple sequence repeat，ISSR）和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）等，这些技术在种质资源遗传多样性与系统发育分析、品种指纹图谱绘制、遗传纯度检测、遗传连锁图谱构建及基因标记定位与克隆等方面被广泛应用［7］。分子标记应用于二倍体苜蓿遗传图谱的构建及相关研究较早，也比较成熟，最早的二倍体苜蓿遗传图谱是以紫花苜蓿W2xiso和蓝花苜蓿PI440501杂交获得的F2群体为材料，用130个RFLP标记构建了包含10个连锁群，覆盖图距467.5cM的遗传图谱［4］。之后通过检测苜蓿属多年生和一年生苜蓿的SSR标记，又补充了9个SSR标记使该图谱的遗传距离达到646.5cM［8］。利用紫花苜蓿变种和蓝花苜蓿杂交的F2重组群体也构建了遗传图谱，该图谱具有包括RFLP、RAPD、同功酶标记和表型标记共计89个分子标记［4，8］。此外，采用RFLP、RAPD绘制了二倍体栽培苜蓿F1群体和1个回交群体的遗传图谱，并用16个公共标记整合成1张包括130个标记、8个连锁群的图谱［9］。此后，以黄花苜蓿、蓝花苜蓿、二倍体紫花苜蓿和截形苜蓿等不同材料为亲本，对其杂交后的F1和F2群体构建了较为饱和的二倍体苜蓿遗传图谱［10－13］，但不足之处是这些遗传连锁图谱利用的是不同的二倍体群体和不同的标记，因此不能完全融为一体。

四倍体紫花苜蓿由于具有四倍体遗传特性和自交不亲和特点，使其与二倍体苜蓿相比进行分离群体的分析更困难［10－13］，其遗传图谱构建进程相对缓慢。目前，只有为数不多的几个完整的四倍体苜蓿遗传图谱的报告。最早的报道是利用四倍体苜蓿F1群体，分析32个RAPD标记的分离结果，发现了9个连锁群，分别属于4个连锁组，并且研究了构建四倍体苜蓿遗传图谱的策略［13］。四倍体苜蓿的连锁图谱构建的困难主要在于对3种杂合基因型位点剂量的鉴定。有的分子标记如SSR和RFLP等不能区分四倍体杂合体基因位点单剂量、双剂量或三剂量几种类型，即在技术上鉴别AAAa，AAaa和Aaaa是不可能的。目前四倍体苜蓿遗传图谱的建立存在2种途径，一种是基于Brouwer和 Osborn［14］提出的利用单剂量位点（single dose alleles，SDAs）检测和估计分子标记间的连锁距离。SDAs在配子体中的分离情况为1∶1（有∶无），这与简单的二倍体基因型中的一个显性等位基因类似。利用一代回交群体，一套基于SDA的四倍体苜蓿遗传图谱在2005年完成［15］，包含了所有8条染色体组。另一途径是利用专门用于建立同源四倍体物种遗传图谱的软件TetraploidMap［16］，采用F1群体，同时利用单剂量和双剂量的分子标记作图。通过这一途径已成功地建立了一套四倍体苜蓿遗传图谱［17］。

然而，大多数分子标记，如：SSR、AFLP等是不能够满足基因的精细定位和全基因组关联研究［18］。SNP是最新发展的第三代分子标记技术，是目前最具发展潜力的分子标记，因其在基因组中数量多、分布广，且具有遗传稳定性高、等位基因性，在基因分析过程中不需要根据片段大小将DNA分带，可实现大规模自动化，适合于数量庞大的检测分析。随着高通量检测技术（基因芯片、genotyping－by－sequencing）的发展，高通量SNP基因分型技术已经成为全基因组关联分析与特异基因精确定位的重要手段。在高密度遗传图谱构建、性状作图和基因的精确定位、群体遗传结构分析以及系统发育分析等方面具有广阔的应用前景［18－19］。目前，在美国开始采用SNP技术对四倍体苜蓿和二倍体苜蓿群体构建高密度的遗传连锁图谱，初步获得了一些与产量、秋眠性、抗寒性及水分利用效率性状相关的 QTL位点［20－23］。

2 苜蓿遗传连锁图谱的构建与特点

目前，已有许多二倍体苜蓿和四倍体苜蓿的遗传图谱被构建成功。尽管早期的几个图谱对连锁群体的定名有随机性，但大部分图谱的连锁群与蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）所对应的染色体紧密联系。连锁群的长度范围为234～794cM，并且许多图谱具有严重的偏分离标记［15，24－28］。有趣的是，用F2代群体构建的连锁图谱中多数偏分离标记是有利的杂合子［14］，这表明有利于对有活力基因的超显性与伪超显性合子的选择。尽管二倍体图谱简单，但是四倍体苜蓿品种构建的图谱将为苜蓿育种提供更多的信息，具有重要的使用价值。苜蓿由于具有四倍体遗传特性，因此它的4个同源染色体在减数分裂是均可与其他几个染色体配对。这种双价体配对的优势限制了双倍型降低的发生［26］。四倍体遗传特性比二倍体更为复杂——4个等位基因可以出现在1个给定的个体并且任何1个等位基因的剂量范围从0到4都有可能。这些复杂的情况是四倍体苜蓿遗传图谱构建的挑战，尤其是等位基因的剂量不确定的时候。遗传作图软件“TetraploidMap”［18］能够把显性和共显性标记结合，实现四倍体苜蓿的连锁图谱构建［28－31］。

许多与产量［26，30－31］、抗寒性［32－33］、持久性［34］、耐铝性［35］和水分利用效率［36］等表型性状相关的 QTL 已经在四倍体苜蓿连锁图谱上进行了定位。但是也存在一些潜在的因素限制了四倍体苜蓿图谱的精确性和有效性。首先，分子标记数量有限，遗传连锁图谱的饱和度差，而且构建的连锁图谱是由4个同源染色体组成，这4个同源染色体的饱和度不能确定［26］，Markers在4条染色体分布不均匀，影响了四倍体苜蓿遗传图谱的准确性。其二，遗传作图群体数量小，也是影响遗传图谱和QTL定位准确性的重要因素。四倍体苜蓿群体遗传作图不同于二倍体苜蓿，在四倍体苜蓿群体中每个同源染色体重组的几率只有50%，而且每对同源染色体配对的机会占群体单株数的16.7%［37－38］。迄今为止，所有的作图群体不超过200个单株，很可能导致对QTL数量低估而对其作用效率高估。此外，如果QTL在父母本中存在多态性，那么在这个群体中检测QTL的能力就偏低。目前还没有开发出合适的计算机程序用于区间作图的合成，分析QTL之间的互作以及评估基因与环境之间的互作。因此，某种程度上，这一理论还不能完全应用于同源四倍体苜蓿的育种方案。

最新发展的高通量SNP基因分型技术将是构建高密度遗传连锁图谱与重要农艺性状基因在染色体上精确定位的重要手段。美国最近在这些方面取得了很大的进展，通过454测序技术，在2个抗旱和非抗旱基因型间发现了近4万SNPs，同时发展了高分辨溶解曲线（high resolution melting，HRM）的基因分型高通量平台，可以对四倍体苜蓿进行精准的SNP剂量鉴定［18］。美国遗传育种学家Brummer实验室已经完成了对23个四倍体与4个二倍体苜蓿转录组的测序，包括从美国的苜蓿育种公司得到的经典苜蓿基因型。从中发现了25000个Unigene以及900000个SNPs。这项研究鉴定的SNPs在豆科信息库中已经被公布［39］。该项研究的重大进展为四倍体苜蓿高密度遗传图谱的构建及重要农艺性状的QTL定位奠定了重要的基础。最近，他们在发现的900000个SNPs中选取了10000个来自关键性状候选基因的SNP，并合成了Illumina iSelect高通量基因芯片，对现存的2个苜蓿群体进行了SNP基因分型。这些新添加的SNP分子标记将大大提高基因图谱的分子标记密度，帮助对已知QTL的精准定位，并且可以鉴定新的QTL位点。

3 苜蓿重要性状QTL定位及其应用与发展趋势

QTL图谱是鉴定控制数量性状基因的一种常用方法，对于探索自然遗传的变异发挥着重要的作用。在二倍体和四倍体苜蓿中已经建立了一些基因连锁图谱。应用QTL作图，一些重要的农艺性状，如产量［30－31］、耐寒性［32－33］和耐铝［35］等QTLs已经鉴定出来。然而，由于有限的基因图谱分辨率，大多数的QTL定位在很大的区间间隔内。随着大量SNP标记和高效的高通量基因分型手段的开发，与重要农艺性状相关的基因已经在玉米和水稻（Oryzasativa）中成功的精细定位。由于紫花苜蓿中分子标记的数量较少，重要性状基因的定位有一定的局限性。

目前，在苜蓿中定位的主要QTL位于较大的染色体区段，如果这些QTL要在育种中得到应用必须缩小定位区间并加以验证。尽管在同源四倍体精细作图QTL定位的研究还非常少，但是具有代表性的非接瘤表型性状的遗传位点nn1已经完成了精细定位［40－41］。这个位点的基因已经在四倍体苜蓿中被克隆［41－42］。这个位点的精确定位是首先用一个四倍体苜蓿F2群体的800个单株在一个候选区域作图，然后用二倍体苜蓿连锁图谱确定这个区域所用的分子标记，然后对2000多个单株的F2群体进行精细作图。最后，应用二倍体苜蓿成熟的遗传图谱，并通过比较作图来进一步完成QTL的定位。

已有大量实验证实在蒺藜苜蓿中鉴定的基因或QTL，对苜蓿的遗传改良具有一定的应用价值。如，苜蓿抗炭疽病的一个主效基因（RCT1）在蒺藜苜蓿中被克隆［43］，苜蓿抗春季黑茎病和叶斑病的QTL也在蒺藜苜蓿的遗传图谱中被确定［44］，但是它们的抗性没有得到证实。此外，与氮素营养［45－46］、开花时间以及形态特征［47－48］相关的QTL也被鉴定。近几年，通过基因组测序发现苜蓿近缘种蒺藜苜蓿与四倍体苜蓿有高度的共线性关系［49］，因此，蒺藜苜蓿遗传图谱构建与QTL定位研究为四倍体苜蓿的相关研究奠定了良好的基础［40－51］。

近年来，随着分子标记及高通量基因分型技术的发展，美国已经在27个苜蓿基因型中通过转录组测序挖掘出了25000个表达序列标签（expressed sequence tags，EST）序列和90万个SNP位点［39］。这些EST序列和SNP位点为构建遗传图谱、候选基因定位和准确定位等提供遗传和基因组资源。10KIllumina的苜蓿SNP芯片已经成功地开发，为苜蓿研究者和育种工作者提供了高通量基因分型平台［39］。最近，美国塞缪尔罗伯特诺贝尔基金会正在利用基因芯片，对现存的苜蓿群体进行SNP基因分型，添加大量新的SNP分子标记到原来的低密度遗传图谱中去。部分QTL也已被定位于遗传图谱上。新的SNP分子标记将提高已知QTL的精准定位和鉴定新的QTL位点。Brummer博士研究组已经获得了苜蓿的基因分型序列，并成功地开发了四倍体苜蓿GBS数据分析通路［52］。这些基因组资源和先进的基因分型技术将会促进在高通量QTL作图、全基因组关联分析（genome wide association studies，GWAS）、全基因组选择（genome selection，GS），候选基因关联分析和精细作图中QTL 的挖掘和验证［52－53］。

4 关联作图研究现状

关联作图（association mapping）的方法也可以对重要性状进行QTL定位，所用的作图群体可以是收集的地方品种或育种用的品系［54－55］。关联作图群体与家族型作图群体相比在某一特定性状上将有更多的多态性QTL位点并在多个性状上产生变异。因此，为遗传作图提供更广阔的推理空间。此外，在育种群体中，关联作图可以直接提供标记信息从而立即加速遗传增量。与家族型QTL作图类似，关联作图也依赖于一个标记和目标基因（或QTL）之间的连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）。由于重组的结果，与家族型QTL定位分析相比，关联作图也能精确定位QTL，但由于连锁不平衡发生在基因组中更短的距离内，所以需要分子标记的密度更大才能对 QTL定位［56］。

连锁不平衡的程度取决于群体的遗传史。在1个普通的具有多样性的二倍体群体中，木质素生物合成途径中4个基因的连锁不平衡迅速衰减到1kb以内［57］。在1个具有遗传多样性的四倍体苜蓿种质资源中调控开花的基因（CONSTANS－LIKE）中也发现了连锁不平衡的快速衰减的现象［58］。LD快速衰减的现象可能是由于苜蓿杂交的特性以及苜蓿种质资源收集中保持有效的群体数量。紫花苜蓿育种群体来源于父母种质其相对遗传范围狭窄，使LD足够广泛避免了关联作图中所需的成百上千标记。尽管SSR分子标记的高突变率可能导致对LD的高估，但仍可以合理评估区间为1Mbp左右的四倍体苜蓿育种群体广义连锁不平衡［57］。为了便于苜蓿关联作图分析，目前已出版了用于评估同源四倍体不同分子标记之间连锁不平衡的计算机软件程序［23］，可以针对不同群体进行LD模式的评估。

5 全基因组选择研究现状及发展趋势

基因组选择（genomic selection，GS）是于2002年被首次提出，是利用覆盖全基因组的高密度分子标记进行辅助选择的一种方式，所有的QTL都至少与一个分子标记存在连锁不平衡，甚至可以追溯到大量影响不同数量性状的基因，从而实现对数量性状进行更准确的评定，在很大程度上实现了标记辅助选择的优势［59］。基因组选择得以实现归功于基因组序列中发现了大量的单核苷酸多态性（SNP），并且新的技术手段可以有效地对这些大量的SNP进行基因分型。模拟研究与育种试验结果表明，遗传标记可以高度精确地预测育种值，但是对于群体样本与分子标记评估效应存在差异时要求有更多的试验进行专门的验证。然而，通过基因组数据评估育种值的理想方法是计算已知基因型的个体在每个QTL位点育种值的条件均值。开展基因组选择研究的重要组成部分是通过QTL效应的贡献率计算条件均值。在实际育种中，通过分子标记基因型评估育种值的方法都很相似，但是，越来越多的序列和SNP数据的获得将成为评估育种值的最理想方法。基因组选择研究计划的实施将对遗传评价体系和遗传改良技术产生深远的影响，该项新型育种技术正使全球动植物遗传改良发生重大变革［59－62］。因此，全基因组选择将成为全球最受关注的研究热点，在未来的育种实践中会有广阔的应用前景。

基因组选择的最基本思路：在基因组中存在大量遗传标记（SNP），影响性状的所有基因都至少与1个标记紧密连锁，通过对所有标记效应的估计，实现对全基因组所有基因效应的估计，利用估计的标记效应计算个体育种值，即基因组育种值（genomic estimated breeding value，GEBV），然后根据 GEBV的大小（或结合系谱、后裔信息）进行选择。在全基因组选择中，要计算群体中每个单株的基因组育种值（GEBV），每个育种值的计算是基于1个模型，该模型包括影响每个性状的所有标记。选择是建立在基因组育种值的基础上，而不是依靠表型性状的信息。实际上，全基因组选择的价值在于表型性状仅仅是用来建立和改进育种模型，而基因组育种值则是通过DNA和标记的评估来进行预测。正像在传统的表型选择中，建立育种参数的同时，对多个性状进行选择。模拟研究表明，与表型选择和分子标记辅助选择相比较，全基因组选择对多个QTL控制的复杂性状在单位时间内能够获得更大的遗传增益，这取决于全基因组选择预测模型的准确性，模型的准确性取决于性状遗传力，群体大小，连锁不平衡的广度和标记的数量［60－63］。

为了建立一个全基因选择模型必须进行表型性状和分子标记数据的收集，实际上是在进行一个平行的表型选择育种方案。一旦模型建立好，通过模型中确定的全基因育种值可以对每个个体进行评估和选择。值得注意的是表型选择的评价将会不断在表型选择育种方案中进行，但是表型评价不仅在被选择的植物资源中具有重要的作用，而且也将为进一步改进全基因组选择模型提供补充的信息［59－60］。GS选择是通过对尽可能多的后代群体单株进行基因分型后基于基因育种值评估的基础上进行。模型的更新对GS很有必要，不仅为分子育种值提供补充的数据，而且在选择中可以重新评估每个标记随着等位基因变化的权重。随着测序技术的快速发展，基因分型成本的大大降低，基因组选择比表型性状选择不论在时间和成本效益上均具有更强的优势［61－64］。

目前，已有报道GS成功地应用于牛的育种中，而在植物育种中相关的报道还鲜为少见［60－61］。对紫花苜蓿而言，应用GS需要预测模型能够解释其四倍体和高度杂合的特性，这无疑与二倍体苜蓿相比选择过程变得更为复杂。因此，在四倍体苜蓿中评价等位基因的剂量比简单地确定特定等位基因的存在或缺失就显得更重要［52－53］。此外，许多标记需要估算其成本效益，要获得大批量分子标记位点的数据最经济有效的方法是通过测序进行基因分型（GBS）［65－66］。但是，四倍体不同于二倍体和自交品种，GBS应用于杂合性高的同源四倍体苜蓿将面临2个限制因素：首先，在同源四倍体中，某个个体特定位点缺失数据的补充难度很大几乎无法实现，而在自交二倍体中，缺失数据的补充通过紧密连锁标记的基因型就可以完成［52，66］。第二，需要深度测序获得每个位点的剂量信息。然而，这种方法可能比其他方法需要更高的成本，但随着测序成本的降低，这种方法将在近几年会成为新的发展趋势。

6 讨论及展望

随着分子标记手段的不断更新和基因组图谱的日趋饱和，其应用也随之向深度和广度推进［53］。目前，已将分子标记辅助选择育种技术与传统育种方法相结合成功应用于动植物育种中，极大地促进了动植物育种的选育进程。然而，最新发展的全基因组选择与分子标记辅助选择相比，更具有无可比拟的优势［59］。

分子标记辅助选择仅能对部分遗传变异进行检测，而且容易将其遗传效应值估计过高。此外，分子标记辅助选择关注的是对少数几个数量性状位点进行定位，预期通过精确定位这些QTLs确定主效基因的位点。全基因组选择方法则能够方便地对所有遗传变异和遗传效应进行准确检测和估计。其研究目的不是鉴定功能突变，而是应用随机的一组全基因组的标记来预测育种值。由于这种方法跟踪所有的遗传变异，希望对候选个体在不需要表型评价鉴定的基础上可以精确的获得育种值［60－61］。在短期内，全基因组选择使育种值的计算变得更为复杂化，尤其是通过国家育种评价系统来计算。但是，从长远目标来看，育种值和遗传值的评估模型完全依赖于基因分型个体的DNA标记，而不受研究个体的干扰。因此，当前全基因组选择受到高度的重视，但值得注意的是需要更多的验证，才能得到广泛的应用［59］。

全基因组选择对加快育种进程更胜一筹。经过第一代表现型鉴定并建立基因型和表现型的关系后，随后全基因组选择可以在温室通过反季节加代的方法来进行，一年可以完成3个轮回的选择，有效地缩短育种进程，降低育种成本。分子标记辅助选择技术很难同时对多个数量性状进行有效选择，且因不同性状的标记往往不同，增加了检测成本［60－63］。此外，全基因组选择可以在基础群体中对多个数量性状进行表型检测并且对各个标记的效应进行估计，在育种群体中利用相同的SNP标记对所有性状进行分析。尤其是基因芯片技术和高通量基因分型检测与分析等新型技术的出现不仅为基因的定位、表达研究提供了新的工具，而且大大降低了分子标记应用的费用。相信在不久的将来，通过模式植物水稻、拟南芥（Arabidopsisthaliana），尤其是豆科模式植物蒺藜苜蓿的基因组计划和相关研究的影响下，全基因组选择方法在苜蓿上的应用研究必将迎来一个迅速发展的时代［62－66］。

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