Toll样受体4在MPTP帕金森病小鼠模型十二指肠和远端结肠的表达＊

方 鑫， 李小兵， 周美鸿， 彭毓棻

南昌大学第一附属医院神经内科，南昌330006

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种常见的神经系统变性疾病，以中脑黑质多巴胺（dopamine，DA）能神经元变性为特征，其确切病因目前仍不完全清楚［1］。目前认为神经炎症参与帕金森病的病理进程［2］。近来有研究发现帕金森病可能从肠道起病，其病理生理过程与肠道系统关系密切［3－4］。Toll样受体4（TLR4）是细菌内毒素脂多糖（LPS）的受体，已经有研究显示TLR4在1－甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氢吡啶（MPTP）帕金森病小鼠模型脑内表达增加［5］。在帕金森病患者，LPS结合蛋白（LBP，是反映LPS暴露的指标）增高［6］，众所周知，LPS与TLR4相互作用参与某些胃肠疾病的肠道炎性过程［7］，而TLR4在帕金森病肠道的表达尚无相关报道，本研究初步探讨MPTP帕金森病小鼠模型十二指肠和远端结肠TLR4表达的变化。

(2)实验二。在原水温仪探头附近上下分别再放置两个新的水位仪探头，进行同期不同层观测数据对比分析，水温探头放置情况如图3。比测过程中在185 m(命名：比1温)、201 m(命名：原温)的两个探头间歇出现突降，然后缓慢恢复的现象(图4)，而216 m(命名：比2温)探头未记录到这种变化。每次变化在0.01～0.1 ℃，185 m和201 m幅度基本一致，时间同步性较好。

1 材料与方法

1．1 主要仪器和试剂

电泳系统（美国Bio－Rad公司）；Leica石蜡切片机；MPTP（Sigma－Aldrich公司）；一抗 TLR4（Santa Cruz公司，sc－30002）；免疫组化试剂盒（福州迈新公司）。

1．2 动物模型的构建和实验分组

8～10周龄雄性C57／BL6小鼠（购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司），帕金森病小鼠造模（MPTP，腹腔注射，20mg／kg，每隔2h1次，共3次，总剂量为60mg／kg），对照组注射等量的磷酸盐缓冲溶液（PBS）。MPTP剂量和造模方法具体参照文献［8］。实验动物随机分为4组：PBS对照3d组、PBS对照7d组、MPTP模型3d组、MPTP模型7d组，每组8只小鼠。所有小鼠在PBS或MPTP末次处理后第3天或第7天处死，取出十二指肠和远端结肠组织。

养殖生产实践证明，青虾与小龙虾混养是可行的。在饲养期间要注意以下的问题：①要合理控制青虾与小龙虾的放养密度，密度过大时小龙虾可能摄食青虾，青虾也可以摄食小龙虾。②混养池塘水体的溶解氧应当保持在5.0mg/L以上，最低也不能低于3.0mg/L。③要保证充足的饲料供应，以防青虾与小龙虾之间，或青虾内部间，或小龙虾内部间相互残杀。④青虾与小龙虾一旦达到商品规格，即捕捞出售。

1．3 Western blot检测TLR4

东营市地处黄河尾闾渤海之滨，那一望无际的荒滩野涂，常让人疑心它与古老文明无缘。其实，早在6 000年以前，东营市就出现了人类聚落遗址。目前东营市共发现新石器时代古文化遗址17处，其中傅家遗址和五村遗址内涵丰富，出土文物特点突出，是鲁北地区最具代表性的大汶口文化遗址。

1．4 免疫组化检测TLR4

采用盐酸(1+1)溶解铝土矿试样，分别用氨水和碳酸铵沉淀法消除铝、铁和钙的干扰，过滤，在酸性溶液中，加入铬酸钡悬浊液与硫酸根生成硫酸钡沉淀和铬酸根离子(式1)，用氨水调节pH值至9～10，过滤除去多余的铬酸钡和生成的硫酸钡，滤液即为被硫酸根所置换出的铬酸根溶液，通过铬酸根的吸光度值间接计算出硫酸根的含量。

裂解液与组织混合、匀浆、裂解，蛋白样本用BCA法定量（碧云天公司），混合用5×上样缓冲液，煮蛋白5min后放置－80℃保存备用。12%SDS凝胶电泳并且NC膜转膜。用5%牛奶封闭1h，TLR4一抗（1∶300，Santa Cruz公司，sc－30002），βactin（1∶1 000，Santa Cruz公司，sc－47778），4℃孵育过夜。次日TBST洗膜，孵育二抗（Goat Anti Rabbit IgG／HRP，1∶5 000），TBST洗膜。用ECL显影，扫描X线片，进行灰度分析。

标本处理：组织按常规进行免疫组化检测前处理（固定、包埋和切片，切片厚3μm），切片常规脱蜡，梯度乙醇水洗，石蜡切片组织抗原修复，兔来源的多克隆抗TLR4一抗，稀释度1∶200（Santa Cruz公司，sc－30002）。采用迈新公司免疫组化试剂盒行免疫组化检测。按试剂盒说明书进行免疫组化染色。DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。TLR4阳性染色为黄色或棕黄色。

1．5 统计学分析

与PBS对照3d组和7d组相比，MPTP处理后7d组远端结肠TLR4蛋白表达显著增加（均P＜0．05），见图3。在PBS对照组小鼠，远端结肠TLR4蛋白表达低，在MPTP造模后增加。远端结肠TLR4免疫组化检测见图4。

2 结果

2．1 十二指肠TLR4表达

与PBS对照3d组以及PBS对照7d组相比，在MPTP帕金森病小鼠7d组，十二指肠TLR4蛋白表达显著增加（均P＜0．05），见图1。免疫印迹法可见在PBS正常对照组小鼠，十二指肠TLR4低表达，在MPTP造模后表达明显上升。十二指肠TLR4免疫组化检测见图2。

图1 免疫印迹法检测十二指肠TLR4表达Fig．1 Western blot analysis of the expression of TLR4in the duodenum

图2 免疫组化检测十二指肠TLR4表达（×400）Fig．2 TLR4expression in the duodenum detected by immunohistochemistry（×400）

2．2 远端结肠TLR4表达

图3 免疫印迹法检测远端结肠TLR4表达Fig．3 Western blot analysis of the expression of TLR4in the distal colon

图4 免疫组化检测远端结肠TLR4表达（×400）Fig．4 TLR4expression in the distal colon detected by immunohistochemistry（×400）

3 讨论

帕金森病最主要的病理改变是中脑黑质DA能神经元的变性死亡，由此而引起纹状体DA含量显著减少而致病，导致这一病理改变的确切病因目前仍不清楚，遗传因素、环境因素、年龄老化、氧化应激等均可能参与帕金森病DA能神经元的变性死亡过程［1］。MPTP帕金森病小鼠亦存在肠道DA能神经元丢失，近来有研究发现帕金森病可能从肠道起病，帕金森病的病理生理过程与肠道关系密切［3－4］。

Toll样受体参与非特异性免疫，是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁，Toll样受体可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子，当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、黏膜等时，Toll样受体可以识别它们并激活机体产生免疫应答。细菌内毒素LPS是革兰阴性菌的产物，LPS受体复合物包括TLR4，而人体和动物肠道均存在大量的革兰阴性菌，存在 LPS的潜在来源。Noelker等［9－10］进一步研究证实TLR4途径参与DA能神经元丢失，推动了帕金森病发病和病理进程。众所周知，LPS与TLR4相互作用参与某些胃肠疾病的肠道炎性过程发病机制［7］，TLR4途径激活后可启动下游炎性反应过程，在病理条件下，肠道炎性环境可以促进细菌内毒素LPS吸收进入血液。但是帕金森病大脑中LPS的来源一直令人困惑，在其它的肠道炎性疾病中，LPS主要来源于肠道。血液循环中的LPS可以到达脑内，从而启动脑内的TLR4途径，从而诱发典型的帕金森病DA能神经元丢失。TLR4在帕金森病肠道的表达尚无相关报道，在本实验中我们研究帕金森病MPTP小鼠模型十二指肠和远端结肠TLR4蛋白表达水平的改变，结果发现在MPTP处理后7d组TLR4蛋白表达水平增加。这说明肠道TLR4途径有可能参与帕金森病肠道炎性反应过程，促进肠道LPS吸收进入血液系统，进而诱发脑内的炎症反应。

MPTP帕金森病小鼠存在肠道DA能神经元丢失［8］，这与帕金森病脑内DA能神经元丢失的情况类似。也可能存在这样一种可能性：与脑内TLR4途径参与DA能神经元丢失一样，肠道TLR4上调参与肠道DA能神经元丢失。这种推测可在下一步的实验中研究证实。

本实验结果未见国内外相关报道，但我们仅仅初步描述了TLR4在帕金森病模型肠道的变化，未涉及到TLR4下游的具体作用机制，亦未探讨TLR4在更长时程的变化规律。另外，在其它的帕金森病动物模型（如6－羟基多巴胺大鼠模型、鱼藤酮大鼠模型以及转基因动物模型等）肠道TLR4有无类似变化尚无相关文献报道。本研究提供了帕金森病模型TLR4肠道表达的新信息，为下一步的相关研究提供了一定依据。

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