p47phox在高脂血症白兔阴茎海绵体平滑肌中的表达及其意义＊

李 瑞， 孟祥虎， 张 岩， 王 涛， 杨 俊， 王少刚， 杨为民， 饶 可， 刘继红

华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科，武汉430030

勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）是中老年男性的多发病和常见病。引起ED的危险因素很多，高脂血症被认为是诱导ED发生的重要危险因素之一。饶可等［1］发现在中国血脂异常的人群中，ED的发病率高达47%，而在血脂正常人群中ED的发病率仅为30%。目前有研究认为高脂血症ED可能是由于过度氧化应激引起［2］。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶是机体内催化活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生的一类十分重要的酶，其胞质亚基p47phox在多种组织的氧化应激反应中起着始动、枢纽性作用［3－5］。NADPH氧化酶可以通过催化NADPH的单电子，合成过量的ROS，过量的ROS降低NO的产生，并且降低它的生物学活性，进而影响勃起功能［6－9］。本研究旨在检测NADPH氧化酶亚基p47phox在正常白兔和高脂血症诱导的白兔阴茎海绵体平滑肌组织中的表达差异，探讨p47phox在高脂血症导致ED发生中的作用。

1 材料与方法

1．1 实验材料

新西兰白兔：由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供［合格证号：SYXK（鄂）2004－0028］；胆固醇（200g／瓶）：武汉亚法生物技术有限公司；Real－time PCR试剂盒：日本 TaKaRa公司；羊抗兔p47phox多克隆抗体：美国Santa Cruz公司；小鼠抗兔GAPDH单克隆抗体：江苏碧云天生物技术研究所；引物由大连宝生物公司合成；Powerlab四通道生理记录仪：澳大利亚 AD Instruments公司；Mx3000型荧光定量PCR仪：美国Stratagene公司；普通饲料：武汉万千佳兴生物科技有限公司。

1．2 模型的建立及评估

4月龄雄性新西兰白兔40只，体重（2．2±0．2）kg（2．0～2．5kg）随机分为2组，每组各20只，喂养时间为8周。对照组白兔喂普通饲料；实验组白兔喂高脂饲料（1%胆固醇＋7．5%猪油＋8%蛋黄粉）。实验开始前，空腹12h，分别抽取实验组和对照组白兔耳缘静脉的静脉血，送华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科检测空腹血总胆固醇水平。喂养8周后再次检测空腹血总胆固醇水平。喂养前后分别称体重。喂养8周后用空气栓塞处死白兔，剪下阴茎，去除尿道、阴茎表面结缔组织和阴茎背神经，新鲜标本用于实时荧光定量（Real－time）PCR，其余标本蘸干称重后迅速放入液氮保存用于Western blot检测。

1．3 Real－time PCR检测

Real－time PCR检测阴茎海绵体平滑肌p47phox的mRNA表达，按说明书用Trizol提取组织的RNA，并将RNA逆转录成cDNA，引物序列见表1。95℃预变性30s后进入45个循环：95℃变性5s，55℃退火20s，72℃延伸10s；延伸后72℃采集荧光。以上实验重复进行3次，选择相对定量的方法分析实验结果，p47phox基因的相对表达量采用2－ΔΔCt计算，ΔCt＝Ct p47phox－CtGAPDH，ΔΔCt＝ΔCt实验－ΔCt对照

表1 引物序列Table 1 The sequences of the primers

1．4 Western blot检测

采用蛋白裂解液和超声破碎法裂解组织，取上清液BCA法测定蛋白浓度。灌制SDS－PAGE凝胶（10%分离胶、4%浓缩胶），取20μg总蛋白恒压电泳，湿转法恒流转膜。5%DSM／TBST封闭2h；5%DSM／TBST 1∶200稀释、一抗4℃孵育过夜；加入1∶5 000稀释二抗，室温孵育2h；增强化学发光显影，UVI凝胶成像系统摄像，照片经扫描后以Quantity One软件分析条带灰度值。

1．5 统计学方法

2 结果

2．1 喂养前后对照组和实验组白兔体重和血总胆固醇水平比较

对照组白兔喂养8周后血总胆固醇水平与喂养前差异无统计学意义（均P＞0．05）。实验组白兔接受高脂饲料喂养8周后体重和血总胆固醇水平均明显高于喂养前，而且实验组白兔喂养后血总胆固醇水平明显高于对照组白兔的血总胆固醇水平（P＜0．01，表2）。

表2 喂养前后对照组和实验组白兔体重和血总胆固醇水平比较（±s，n＝20）Table 2 Comparison of the body weight and the levels of the total serum cholesterol between control and experimental groups before and after the feeding（±s，n＝20）

表2 喂养前后对照组和实验组白兔体重和血总胆固醇水平比较（±s，n＝20）Table 2 Comparison of the body weight and the levels of the total serum cholesterol between control and experimental groups before and after the feeding（±s，n＝20）

与喂养前比较，＊P＜0．01；与对照组比较，△P＜0．01

组别 体重（kg） 血总胆固醇水平（mmol／L）喂养前 喂养后对照组喂养前 喂养后1．86±0．36 2．19±0．22 3．14±0．04 3．39±0．28实验组1．95±0．14 2．40±0．24＊ 3．22±0．15 24．21±0．84＊△

2．2 对照组和实验组白兔阴茎海绵体平滑肌中p47phox mRNA表达的比较

对照组和实验组白兔p47phoxmRNA表达比较，应用Real－time PCR检测发现在对照组和实验组阴茎海绵体平滑肌组织中的ΔCt值分别为（12．75±3．40）和 （10．01±2．92）。根 据 公 式 2－ΔΔCt，得 出p47phoxmRNA在高脂血症白兔阴茎海绵体平滑肌组织中表达是对照组的6．68倍（表3）。

表3 p47phoxmRNA在对照组和实验组白兔阴茎海绵体平滑肌中的表达差异（±s，n＝20）Table 3 The expression of p47phox mRNA in penile corpus cavernosum smooth muscles in control and experimental groups（±s，n＝20）

表3 p47phoxmRNA在对照组和实验组白兔阴茎海绵体平滑肌中的表达差异（±s，n＝20）Table 3 The expression of p47phox mRNA in penile corpus cavernosum smooth muscles in control and experimental groups（±s，n＝20）

组别 p47phox平均Ct值 NADPH的平均Ct值 ΔCt ΔΔCt 2－ΔΔCt对照组 37．58±3．00 24．83±1．60 12．75±3．40 0．00±3．401．00实验组 35．24±0．74 25．23±2．82 10．01±2．90 －1．93±2．92 6．68

2．3 对照组和实验组白兔阴茎海绵体平滑肌中p47phox蛋白表达的比较

应用Western blot检测对照组和实验组白兔阴茎海绵体平滑肌p47phox的蛋白表达发现，对照组白兔阴茎海绵体平滑肌p47phox蛋白表达是（0．34±0．04），而实验组白兔阴茎海绵体平滑肌p47phox蛋白表达是（0．63±0．05），高于对照组白兔（P＜0．05），见图1。

图1 p47phox蛋白在对照组和实验组白兔阴茎海绵体平滑肌中的表达差异Fig．1 The difference in the expression of p47phox protein in penile corpus cavernosum smooth muscles between control and experimental groups

3 讨论

ED影响着世界上众多男性并严重降低他们的生活质量，高脂血症是诱导ED发生的一个十分重要的危险因素，Ossou－Nquiet等［10］发现高脂血症与ED发生密切相关，并且和它的严重程度有相关性。

研究发现在高脂饮食下，猪的心肌组织中高表达 NADPH 氧化酶 p47phox［11］。Espinosa等［12］也发现在高脂饮食情况下，C57BL／6小鼠肌纤维中NADPH氧化酶的亚基p47phox的mRNA水平为对照组的3倍，蛋白的含量为对照组的6．8倍。在本次 实 验 通 过 Western blot 和 Real－time PCR 对p47phox的蛋白和mRNA表达进行检测，发现高脂血症白兔阴茎海绵体平滑肌p47phox的蛋白表达和mRNA水平均较对照组增高。实验结果表明高脂血症白兔阴茎海绵体平滑肌NADPH氧化酶亚基p47phox活性上调。据此认为在高脂血症病理情况下，白兔阴茎海绵体组织中p47phox的活性上调，通过使ROS过度释放，一方面抑制NO－cGMP信号通路，NO释放减少，活性降低，使内皮功能受损，勃起功能下降，另一方面可能激活Rho A／Rho激酶途径，使阴茎海绵体和血管平滑肌收缩功能增强，参与高脂血症诱导的勃起功能下降，但其确切机制仍需进一步研究。

在高脂血症诱导ED过程中p47phox可能发挥十分重要的作用，NADPH氧化酶通过p47phox的磷酸化与p67phox的移位，最后再与胞膜成分gp91phox和p22phox聚集而活化，Rac催化GTP产生能量，将氧催化为超氧阴离子，进而产生一系列活性氧，造成细胞损伤，导致ED［13］。在ED的各种治疗方法中，病因治疗是核心，而目前临床治疗ED的方法如口服PDE5抑制剂、阴茎海绵体内注射血管活性药物和阴茎负压吸引装置等均无法达到治愈ED的目的。在高脂血症诱导ED过程中p47phox发挥非常重要的作用，我们可以将p47phox作为治疗高脂血症诱导ED的有效靶点，应用RNA干扰技术抑制p47phox的活性从而有效抑制NADPH氧化酶的活性，进而抑制氧化应激。Liu等［14］发现应用RNA干扰技术抑制p47phox的表达，可以有效抑制高糖状态下血管平滑肌细胞的氧化应激。因此，我们大胆推测应用基因治疗的方法，抑制高脂血症诱导ED的动物阴茎海绵体内p47phox表达，使阴茎局部NADPH氧化酶的活性下调，减少阴茎局部ROS产生，有望达到有效治疗高脂血症诱导ED的目的。

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