婴幼儿配方乳粉中唾液酸含量的测定

钱振杰，张 恒，陈 敬

(珠海出入境检验检疫局技术中心，广东珠海 519015)

唾液酸(Sialic Acid，SA)是一类神经氨酸的衍生物，广泛存在于多种生物组织中，主要包括N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-羟乙酰神经氨酸(NeuGc)和3-脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖(KDN)等。唾液酸主要的食物来源是母乳，也存在于牛奶、燕窝和鸡蛋中［1］。在大部分哺乳动物组织中发现的唾液酸主要是N-乙酰神经氨酸，其在乳中所占质量比例可达到96%左右，因此通常把Neu5Ac称为唾液酸［2］。唾液酸可通过提高大脑神经细胞的信息传递速度促进婴儿的记忆力和智力发育，还可以提高儿童肠道吸收能力及儿童免疫力，所以部分婴幼儿配方乳粉的生产厂家以此为商品的宣传点，将其产品的唾液酸含量标示于包装之上，一般产品中唾液酸的含量在100～200 mg/100g之间。唾液酸的分析方法很多，主要有分光光度法［3］(UV)、薄层层析法［4］(TLC)、高效液相色谱法［5-7］(HPLC)、脉冲电化学高效阴离子交换色谱检测法［8］(HPAE-PAD)、胶束电动色谱法［9］(MEC)、毛细管区带电泳法［10］(CZE)以及高效液相色谱串联质谱联用技术［11］(HPLC-MS-MS)等。但是，尚没有相关产品的相关国家标准。本研究采用液相色谱法，对水解后的婴幼儿配方乳粉中唾液酸总量的测定方法进行研究，通过系统优化试样水解、衍生和测定条件，建立乳粉中唾液酸含量测定的液相色谱法。该方法对婴幼儿配方乳粉中唾液酸的检测和标示值的确定具有较好的指导意义。

1 仪器与试剂

1.1 仪器与设备

e2695型液相色谱仪，配2475荧光检测器(美国 Waters);分析天平(瑞士 梅特勒-托利多);HS250 Basic型多功能振荡器(德国 IKA);HHS21-8-S恒温水浴锅(上海新苗)。

1.2 材料与试剂

N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)(含量＞98%，标准品);乙腈、四氢呋喃(色谱纯);邻苯二胺(OPD)、硫酸、氢氧化钠、硫酸氢钠及磷酸(分析纯);实验用水为符合GB6682-2008标准规定的一级水。

2 实验方法

2.1 样品溶液的制备

称取约0.2 g～0.3 g(精确至0.001 g)样品，置于25 mL比色管中，加入20.0 mL硫酸溶液(0.1 mol/L)，充分振荡摇匀，置于80℃下水浴2 h，冷却，加入0.625 mL氢氧化钠溶液(6.0 mol/L)调节pH至近中性，加水定容，摇匀后静置3 h，直至上层澄清。

2.2 衍生反应

吸取水解后的上层清液1.00 mL置于15 mL离心管中，再加入1.0 mL浓度为5 mg/mL邻苯二胺溶液(用0.1 mol/L硫酸氢钠配制)，摇匀后置于80℃水浴下衍生50 min，冷却，并用0.2 μm一次性针头式滤头过滤，装瓶待测。

2.3 色谱条件

Agilent SB-AQ C18色谱柱(150mm ×4.6mm，5μm);流动相A:乙腈，流动相B相:1%四氢呋喃水溶液(含0.2%磷酸)皆为体积比;柱温:30℃;流速:1.0 mL/min;进样体积:10 μL;荧光检测器激发波长:231 nm，发射波长:465 nm。梯度洗脱程序如下:0 min(8% 流动相A)-5 min(8% 流动相A)-10 min(30%流动相A)-12 min(30%流动相A)-12.1 min(8%流动相A)-18 min(8% 流动相A)。

在上述色谱条件下，唾液酸的参考保留时间为8.35 min。样品溶液的唾液酸液相色谱如图1所示。

图1 唾液酸样品溶液液相色谱图Fig.1 Chromatograms of sialic acid sample solution

2.4 线性范围

分别吸取1.00 mL唾液酸标准工作液系列于15 mL离心管中，按2.2步骤衍生，冷却过滤，上机检测。以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，见图2。标准溶液在1.00 μg/mL ～60.0 μg/mL线性范围之内线性关系良好，线性方程为y=4 915x-1 645.3，相关系数r2为0.999 8。

图2 唾液酸标准溶液曲线Fig.2 Standard curves of Sialic acid

2.5 精密度试验

对婴幼儿配方乳粉样品进行了6次平行测定，含量及精密度结果如表1所示。此外，通过测定6次平行测定峰面积的标准偏差(SD)与标准曲线方程斜率(k)的比值，我们可得出3倍信噪比(3SD/k)为8.46 mg/100g，故将本方法的检测限定为10.0 mg/100 g。

表1 唾液酸在乳粉样品中的本底值的测定Tab．1 Determination results of samples

2.6 加标回收率试验

取已知含量的婴幼儿配方乳粉样品分别加入低、中、高3个浓度水平的N-乙酰神经氨酸对照品溶液。按上述方法进行添加回收实验，计算3个加标水平的平均回收率和相对标准偏差，结果见表2。

表2 唾液酸在乳粉中的实验室内回收率和精密度数据Tab．2 Spike recovery rates of sialic acid in milk powder

3 结果与讨论

3.1 水解条件的选择

乳及乳品中的唾液酸主要以3种形式存在:游离态、蛋白结合态以及低聚糖结合态。本研究使用稀硫酸对样品中所含唾液酸进行水解处理。不同水解时间下待测物的含量结果如图3所示，60～120 min时间范围内测定结果基本保持稳定，故本方法选择水解时间为120 min，以避免乳粉水解不完全的现象发生。

3.2 衍生剂浓度对实验的影响

唾液酸属于九碳糖类物质，无紫外吸收峰，但在酸性条件下可与OPD反应，生成有荧光性质的衍生物。唾液酸与邻苯二胺的衍生反应机理如图4所示。

本研究针对不同浓度衍生剂存在下待测物的含量进行分析测定，结果如图5所示。实验发现高浓度的衍生剂有利于衍生反应正向进行，但同时过多存在的衍生剂也会造成色谱峰拖尾，影响目标物质的分离，故本方法选择浓度为5 mg/mL的邻苯二胺为衍生剂进行反应。

图3 不同水解时间对测定结果的影响Fig.3 Effect of different hydrolysis times

图4 唾液酸和OPD的衍生反应机理图Fig.4 Derivatization principles of Sialic acid and OPD

图5 不同衍生剂浓度对测定结果的影响Fig.5 Effect of different Derivative concentration

3.3 衍生时间对实验的影响

衍生时间对测定结果的影响如图6所示。实验结果表明，衍生时间在40 min之前待测物峰面积随时间增加不断增大，当时间超过60 min后则出现略微的下降。因此，最终选择50 min作为最佳衍生时间。

图6 不同衍生时间对测定结果的影响Fig.6 Effect of different derivative time

3.4 色谱条件的选择

使用荧光分光光度计对衍生产物进行光谱扫描，结果如图7所示。最终我们选择231 nm作为激发波长，465 nm作为发射波长对衍生产物进行分析。

图7 荧光检测器条件的选择Fig.7 The instrument conditions of Fluorescence detector

4 结论

本研究建立了婴幼儿配方乳粉的柱前衍生荧光液相色谱检测方法，对检测条件进行了优化并对实验结果进行验证。该方法快速、简便，选择性和准确性高、灵敏度和精密度也满足实际工作需要，适用于婴幼儿配方乳粉中唾液酸总量的测定。本方法可作为市售婴幼儿配方乳粉中唾液酸标签值正确与否的确认方法，具有很高的实用性。

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