重组毕赤酵母发酵产PGA的条件优化

罗 倩，黎继烈，王 卫，郭 璐，朱晓媛

（中南林业科技大学 生命科学与技术学院， 湖南 长沙 410004）

重组毕赤酵母发酵产PGA的条件优化

罗 倩，黎继烈，王 卫，郭 璐，朱晓媛

（中南林业科技大学 生命科学与技术学院， 湖南 长沙 410004）

对重组毕赤酵母发酵产青霉素G酰化酶(PGA)的培养条件进行探讨。依据基础盐摇瓶发酵培养基，通过单因素试验考察了接种量、甘油浓度、pH以及诱导过程中氨水浓度、甲醇浓度等因素对PGA表达的影响。并采用Box-Behnken实验设计进行因素组合优化。结果与意义：最佳发酵条件为：甘油浓度40 g/L、氨水浓度0.1%、甲醇浓度1.0%、pH 5.6、接种量10%，在此条件下PGA酶活力达到8 680±12 U/L。本实验结果对下一步利用发酵罐进行重组毕赤酵母扩大培养有借鉴作用。

毕赤酵母；青霉素G酰化酶；培养条件优化；Box-Behnken实验设计

青霉素G酰化酶( Penicillin G Acylase，EC 3. 5. 1.11，简称PGA)是用于抗生素中间体6-氨基头孢烷酸(6-APA)和7-氨基脱乙酰头孢烷酸(7-ADCA)生产的重要酶制剂，目前已经在工业中得到了广泛的应用[1-2]。许多微生物均可以产生青霉素酰化酶，这包括细菌、放线菌、真菌、酵母等[3-4]。近年来，青霉素酰化酶的发展主要是在以下2个方面：一是运用基因工程和蛋白质工程的方法寻找该酶的高产菌株和性能优良菌株；二是探索新的高效的固定化方法，提高酶固定化效率和使用稳定性，改善酶的应用特性。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)有着近年发展起来的一种高效表达外源蛋白的真核系统，其有诸多优点[5-6]：外源基因稳定、目的蛋白表达量高、分泌效率高、并具有甲醇精确调控的醇氧化酶启动子PAOX及日臻成熟的高密度发酵工艺。如今已用这个系统成功的表达了200种以上蛋白，包括病毒的、细菌的、真菌的、动植物和某些人体蛋白[7]。到目前为止，文献中有关毕赤酵母产胞内PGA的报道较少，笔者采用Box-Behnken实验设计对重组巴斯德毕赤酵母的发酵条件进行了研究，以期得到高产PGA的发酵条件，从而为PGA工业应用提供实验基础[8]。

1 材料与方法

1.1 菌 株

毕氏酵母工程细胞株，由中南林业科技大学发酵工程实验室保存。

1.2 培养基

YPD液体培养基，BSM基础盐培养基，以及PTM1配方均采用Invitrogen公司提供的标准配方。BSM需高压灭菌后再加4.0 mL/L过滤除菌的PTM1[9]。

1.3 培养方法

1.3.1 种子扩大摇瓶培养

50 mL种子培养基装入250 mL三角瓶中，灭菌冷却后，于无菌状态下吸取0.5～1.0 mL甘油管菌液，于30 ℃，220 r/min下，培养40 h。

1.3.2 毕赤酵母摇瓶发酵

将培养好的种子液以10%接种量接种到预装80 mL BSM基础盐生长培养基的500 mL三角瓶中，温度30℃，转速220 r/min下培养，每隔24 h补加甲醇至终浓度1%，每隔12 h补加28%氨水至终浓度0.1%，维持培养基中pH值5.5左右，同时亦可补加氮源，培养120 h后，发酵结束。同一水平3组重复实验，以进行统计分析。

1.4 酶活测定方法

酶活测定采用碱滴定法[10]。

1.5 中心组合实验

根据单因素实验结果，确定中心组合实验的因素与水平，进行Box-Behnken实验设计和试验结果分析，最终确定重组毕赤酵母发酵产PGA培养的最佳条件。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 甘油浓度对PGA表达水平的影响

在其它发酵基础培养基成分不变的情况下，甘油按 30、35、40、45、50 g/L比例加入，诱导培养96 h后，测PGA活力。从图1中可以看出，当甘油质量浓度增高时，菌体产PGA表达水平也随之升高，但当甘油浓度大于40 g/L时，PGA表达水平却随甘油浓度升高而减少，说明甘油浓度过低或过高会限制或抑制菌体表达PGA。而甘油浓度为40 g/L时重组毕赤酵母PGA表达水平最高，达到8 319 U/L。

图1 甘油浓度对PGA表达水平的影响Fig.1 Effects of glycerol concentration on PGA activity

2.1.2 氨水浓度对PGA表达水平的影响

补料用的28%氨水预先经过滤除菌，氨水加入量按体积百分比计算分别为0.06%、0.08%、0.1%、0.12%、0.14%，每隔12 h补加1次。诱导培养96 h后，测PGA活力。从图2中可以看出，随着氨水体积分数增高，PGA酶活也随之升高；当氨水体积分数等于0.1% 时，PGA酶活达到8 296 U/L；而当氨水体积分数大于0.1% 时，PGA酶活却随之下降，说明过高的氨水体积分数不利于毕赤酵母的PGA表达，所以本实验选取每12 h补加28%氨水至0.1%。

图2 氨水浓度对PGA表达水平的影响Fig.2 Effects of ammonia water concentration on PGA activity

2.1.3 甲醇浓度对PGA表达水平的影响

以甲醇浓度分别为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的诱导培养基重悬菌体进行诱导培养，每24h补加甲醇维持以上浓度。诱导培养96 h[11]后，测PGA活力。甲醇浓度过低，会限制菌体生长和诱导强度；浓度过高，则对菌体产生毒性。从图3中可以看出，最适甲醇浓度为1.0%，PGA表达水平达到8 448 U/L；浓度超过1.5% 时，甲醇对菌体PGA表达水平有抑制作用。

图3 甲醇浓度对PGA表达水平的影响Fig.3 Effects of methanol concentration on PGA activity

2.1.4 pH对PGA表达水平的影响

配制不同pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的诱导培养基，诱导培养96 h后，测PGA活力。由于外界的pH值变化会改变菌体细胞内的pH值，从而影响细菌的代谢反应，进而影响细胞的生物量和基因产物的表达[12]。从图4中可以看出，最适pH值为5.5，此时的PGA表达水平达到8 402 U/L。

图4 pH值对PGA表达水平的影响Fig.4 Effects of pH on PGA activity

2.1.5 接种量对PGA表达水平的影响

试验不同的接种量对毕赤酵母表达PGA的影响，接种量大小的控制在很多细胞培养和代谢物积累中都发挥着重要作用[13]。分别以4%、6%、8%、10%、12%的接种量接种到BSM基础盐生长培养基中，结果如图5所示，当接种量为10% 时，此时的PGA表达水平达到8 511 U/L。

图5 接种量对PGA表达水平的影响Fig.5 Effects of inoculum on PGA activity

2.2 Box-Behnken 实验结果与分析

在单因素实验结果的基础上，运用Box-Behnken实验设计考察甲醇体积百分比（X1）、氨水体积百分比（X2）和培养基pH值（X3）这3个因素对响应值Y（PGA酶活力）的影响，各个因素的水平和实验结果见表1和表2。

利用SAS.8.1软件对表2中数据进行多元回归拟合，二次多项回归方程为：

Y=8692.33+31.62X1-61.563X2+182.50X3-284.00X1X2+136.75X1X3-73.25X2X3-1 105.67X12-778.17X22-1 123.42X32

表1 响应面实验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

表2 响应面实验设计和结果Table 2 Design and results of response surface experiments

2.2.1 二次回归拟合及方差分析

对SAS软件拟合所得方程进行分析，表3为对该拟合方程进行方差分析的结果，表4为回归方程系数显著性的检验结果。在回归方程中，是通过F检验来判定各变量对响应值影响的显著性的，当其概率P的值越小时，则相应变量的显著程度就越高。表3中的模型P＜0.01，表明回归模型极显著，而其校正决定系数R2Adj=0.947 7，表明总变异中仅有5.23%是不能由该模型来进行解释。相关系数R2= 0.981 3以及Lack of Fit值(0.101 8＞0.05)，表明该模型拟合程度良好，实验误差较小，回归方程是能够较好地描述各因素与响应值之间的真实关系。

从表4中可以看出，在实验的水平范围内显著(P＜0.05)的因素为交互项XX以及二次项X2、

121X2

2和X32。对这一现象的可能解释是，毕赤酵母在以甲醇作为诱导物及碳源，合成PGA过程中，需通过呼吸作用产能及相应的还原力NADPH，此过程中释放出来H+部分溶于培养基后pH偏酸；而PGA的合成过程中需要构建酰胺键，随着氨水的补料加入，环境pH会上升，故X1与X2两因素交互作用明显。试验设计过程中，pH跨度为5.0～6.0以及发酵培养基中缓冲液系统的存在，此时培养基中由于细胞的新陈代谢甲醇快速消耗，而酶的合成相对缓慢，所表现出来的是pH与甲醇、氨水补料的相互作用相对较弱。去除非显著性因素后，重组毕赤酵母产PGA发酵各因素的二次多项回归方程式可简略为：

Y=8 692.33-284.00X1X2-1 105.67X12-778.17X22-1 123.42X23

进一步优化分析可知，回归方程存在稳定点，且稳定点为极大值。对所得的回归拟合方程进行偏导微分处理得到X1、X2和X3的最佳取值：X1＝0.026、X2＝ -0.048、X3＝ 0.085，即甲醇流加体积比为1.01%、氨水补加体积比为0.10%、培养基pH为5.64，在此条件下表达PGA，回归方程预测的PGA活力为8 701.92 U/L。为实验操作方便，取最优条件为甲醇补加体积比1.0%、氨水补加体积比为0.10%、培养基pH值为5.6。

表 3 响应面实验回归方程方差分析†Table 3 Variance analysis of response surface regression

2.3 回归模型实验验证

为检验响应面法所得结果的可靠性，以上述求得的最佳取值下进行重组毕赤酵母PGA表达水平的验证实验，经5次平行实验，实际测得PGA的平均活力为8 680±12 U/L，与理论预测值相比误差为0.25%。范超等[8]采用Box-Behnken实验设计和响应面分析方法，对重组巨大芽孢杆菌产青霉素G酰化酶的发酵条件进行优化，由于重组巨大芽孢杆菌产胞外PGA，胞外酶在发酵过程中被分泌到发酵液中，便于酶活力的测定，该实验的研究方向对本课题有一定的借鉴作用。此外，作为产胞内PGA的毕赤酵母工程菌，在甘油消耗完后，需补料甲醇，此时细胞以甲醇为唯一碳源并诱导细胞代谢产酶，细胞进入诱导表达阶段。在诱导表达阶段，补料量的控制也至关重要，因为甲醇或氨水尤其甲醇的过量会严重毒害酵母细胞，从而会导致发酵失败[14-16]。

表 4 回归系数显著性分析Table 4 Significant analysis of regression coefficients

3 结 论

通过单因素试验、Box-Behnken实验设计对重组毕赤酵母产PGA的发酵条件进行优化，确定其最佳发酵条件为：甘油浓度40 g/L、氨水浓度0.1%、甲醇浓度1.0%、pH 5.6、接种量10%，在此条件下PGA酶活力达到8 680±12 U/L。本实验结果对下一步利用发酵罐进行重组毕赤酵母扩大培养有借鉴作用，从而为PGA工业应用提供实验基础。

[1] 崔 鹏,万 敏.青霉素酰化酶的生产与应用新进展[J].化学工业与工程技术,2005,26(6):42-45.

[2] Parmar A, Kumar H, Marwaha S S, et al. Advances in enzymatic transformation of penicillins to 6-aminopenieillanic acid (6-APA)[J]. Biotechnology Adv.,2000,18(4):289-301.

[3] Vadamme E J. Enzyme involved in β-lactam antibiotic biosynthesis[J]. Advanced in Applied Microbilogy,1977,21:89-123.

[4] Vadamme E J, Voets J P, Microbial penicillin acylase[J].Advanced in Applied Microbilogy,1974,17:311-369.

[5] 戴秀玉.一种值得注意的基因表达系统—巴斯德毕赤酵母[J].微生物学报,1997,36(7): 483-485.

[6] 龙 跃.毕赤酵母工程菌产植酸酶的发酵优化及其耐热稳定性研究[D].广州:华南理工大学,2011.

[7] Gregg J M,Cereghino JL,Shi J, et al.Recombinant protein expression in Pichia pastoris[J].Mol. Biotechnology,2000,16:23-25.

[8] 范 超,黎继烈,吴 浩,等.重组巨大芽孢杆菌产青霉素G酰化酶发酵条件研究[J].中南林业科技大学学报,2011,31(7):124-129.

[9] Hong F, Meinander N Q, Jonsson L J. Fermentation strategies for improved heterologous expression of laccase in Pichia pastoris[J]. Biotechnology Bioeng,2002,79(4):438-449.

[10] Pramod B, Mahajan. Penicillin acylase[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,1984(9):537-554.

[11] 刘振云,沈 露,解凤立,等.毕赤酵母菌分泌表达重组抑肽酶的高密度发酵工艺研究[J].东南大学学报:医学版,2011,30(5): 744-748.

[12] 涂桂云,李 敏.基因工程菌高密度发酵工艺研究进展[J].工业微生物,2004,34(3):49-52.

[13] Fang Q H, Tang Y J, Zhong J J. Significance of inoculation density control in production of polysaccharide and ganoderic acid bysubmerged culture of Ganoderma lucidum[J].Process Biochemistry,2002,37:1375-1379.

[14] Jin H, Liu G Q, Ye X F, et al. Enhanced porcine interferon-α production by recombinant Pichia pastoris with a combinational control strategy of low induction temperature and high dissolved oxygen concentration[J].Biochemistry Eng. Journal,2010, 52(1):91-98.

[15] 袁 强.白地霉PP1315产脂肪酶的纯化及固定化催化性能研究[D].长沙:中南林业科技大学,2010.

[16] 王 挥,张 蕾,黎继烈,等.响应面法优化黑曲霉发酵产单宁酶条件[J].中南林业科技大学学报,2011,31(10):122-126.

Optimization of fermentation conditions for expression of PGA in recombinant Pichia pastoris

LUO Qian, LI Ji-lie, WANG Wei, GUO Lu, ZHU Xiao-yuan
(School of Life Science & Technology, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

The cultivation conditions for Penicillin G acylase (PGA) production by recombinant Pichia pastoris were studied. the inf l uences of inoculum, pH value, concentrations of glycerol, and methanol and ammonia water on the expression of PGA and the cell growth were investigated in shake fl asks with Fermentation Basal Salts Medium by single factor experiments. And the experiments with the Box-Behnken experimental design were conducted to optimize the fermentation conditions of PGA production of recombinant P.pastoris. The results and implications are as follows: the optimum fermentation conditions were obtained (glycerol concentration 40 g/L, ammonia water concentration 0.1%, methanol concentration 1.0%, pH 5.6, inoculum 10%). Under these conditions, the activity of PGA was (8 680±12) U/L. These results will be provide a reference base for the expansion cultivation of recombinant P. pastoris fermentation.

Pichia pastoris; Penicillin G acylation enzyme; cultural condition optimization; Box-Behnken experimental design

S718.8

A

1673-923X(2013)05-0101-04

2012-11-12

国家林业局948项目（2011-4-17）

罗 倩（1988-），女，湖南岳阳人，硕士研究生，研究方向为微生物育种、微生物转化及过程调控；

E-mail：luoqian7747@126.com

黎继烈（1959-），女，湖南岳阳人，教授，博士，博导，研究方向为食品加工；E-mail：lijilie@163.com

[本文编校：吴 毅]