兔戊型肝炎病毒ORF2编码蛋白的抗原表位分析

王松，戴星，董晨，董敏，梁久红，孟继鸿

(1.东南大学医学院，江苏南京 210009;2.东南大学附属中大医院皮肤科，江苏南京 210009)

戊型肝炎(HE)是由戊型肝炎病毒(HEV)引起的一种经粪-口途径传播的病毒性肝炎，呈全球分布。根据全基因组序列分析，HEV可分为4个基因型［1］:1型以缅甸株为代表，2型以墨西哥株为代表，3型以美国株为代表，4型以中国株为代表;其中1型和2型只感染人，3型和4型既感染人又感染动物。自1997年第一株动物 HEV［2］——猪 HEV美国株分离以来，已在多种动物包括非人灵长类动物、啮齿类动物、家猪、野猪、鹿、鸡、马、牛、羊、狗、猫等体内检出 HEV 抗体［3］，并在家猪、野猪、鹿、兔和鸡等动物体内检测到HEV RNA，提示HEV不仅在人类中流行，而且也存在动物宿主，可由动物传染给人［4］。动物HEV传染人的最直接证据来自日本，在HE患者与食物剩余的野猪肉和鹿肉中检出同一HEV［5］。这些研究结果使人们认识到HE是一种人畜共患病。

近年，我国研究人员首先在农场养殖兔体内分离出HEV［6］，基因序列分析显示兔HEV与已知1-4基因型HEV差异较大并可能构成一个新的基因型。此外，兔HEV抗体能被人源HEV抗原检测出来，提示兔HEV可能与已知基因型HEV含有共同的抗原表位。本实验室最近在江苏散养家兔的胆汁标本中成功分离出兔 HEV［7］。本研究选取一株兔 HEV毒株 JS120(GenBank序列号:JQ065059)，通过制备兔HEV ORF2蛋白C端片段p166(aa452-617，R166)及抗-R166的McAbs，进一步研究兔HEV与已知基因型HEV抗原表位的异同，为阐明兔HEV的人畜共患特征及戊型肝炎的诊断和预防提供依据。

1 材料和方法

1.1 抗原的制备

将HEV缅甸株(M73218)、墨西哥株(M74506)、美国株(AF035437)、中国株(AJ272108)和兔HEV毒株JS120(JQ065059)编码 ORF2 p166(aa452-617)基因片段，插入PET28a载体(Pharmacia产品)构建重组质粒，转化大肠杆菌JM109菌株(Promega产品)，表达6His-ORF2融合蛋白p166，经镍柱(Pharmacia产品)纯化的融合蛋白分别命名为 p166Bur、p166Mex、p166Us、p166Chn 和 R166。

1.2 抗R166单克隆抗体的制备

1.2.1 动物免疫和细胞融合 采用常规方法以R166免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠，共3次，每次免疫间隔2周。末次免疫后3 d，取免疫的小鼠脾细胞，在PEG4000的作用下与SP2/0骨髓瘤细胞以10∶1的比例融合，加入已制备有饲养细胞的96孔板，以含20%胎牛血清的HAT培养液置37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中选择培养。

1.2.2 杂交瘤细胞株的建立 用所免疫的R166重组蛋白包被酶标反应板，采用间接ELISA法检测细胞培养板孔上清液，TMB底物显色，测定A450nm吸光度值，P/N＞2.1判定为阳性。杂交瘤细胞筛选时，R166检测阳性，同时无关抗原His-HCV NS3重组蛋白检测阴性为预期McAb阳性孔。阳性孔细胞经2～3次有限稀释法进行亚克隆，至100%培养孔阳性，建立分泌McAb的杂交瘤细胞株，并将克隆化的细胞扩大培养并制备腹水，离心取上清，置-20℃保存。

1.2.3 McAb的类和亚类的鉴定及效价测定 采用上述间接ELISA法以HRP标记的兔抗鼠IgG亚类抗体(KPL产品)及兔抗鼠IgM抗体为二抗(KPL产品)鉴定McAbs的Ig类别;收集小鼠腹水并进行10倍系列稀释，采用间接ELISA法检测抗体效价。

1.3 HEV重组蛋白抗原表位分析

1.3.1 计算机辅助的序列分析 从GenBank中提取HEV缅甸株(M73218)、墨西哥株(M74506)、美国株(AF035437)、中国株(AJ272108)的基因组序列，同时本实验室自行分离鉴定兔HEV并测序，使用LASERGENE计算机软件系统(DNASTAR，Inc.美国 Wisconsin)的MegAlign Program进行计算机辅助序列分析。

1.3.2 ELISA检测 用已知基因1-4型HEV和兔HEV ORF2 p166重组蛋白分别包被酶标反应板，加入不同杂交瘤细胞的培养上清，37℃孵育45 min，洗涤6次，HRP标记的羊抗鼠IgG抗体作为酶标二抗，37℃孵育45 min，洗涤6次，以TMB为底物显色，测定A450nm值，P/N＞2.1判定为阳性。

1.3.3 免疫印迹法(Western blotting)检测 将基因1-4型HEV及兔HEV的p166纯化蛋白，经 SDSPAGE后转至硝酸纤维素膜进行免疫印迹反应，以含5%脱脂牛奶TBST封闭2 h，洗涤3次后分别加入不同杂交瘤细胞培养上清，室温摇动2 h，洗膜3次，加入1∶2 000 HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，室温摇动2 h，洗膜3次，加入DAB(二氨基联苯胺)显色，蒸馏水终止显色，摄像保存。

1.4 McAbs中和活性的鉴定

采用前期建立的基于PCR的HEV体外中和试验［8］，将制备所得的McAbs腹水分别与100倍的HEV最低感染滴度的基因1型、4型HEV及兔HEV混合，37℃孵育1 h后接种单层PLC/PRF/5细胞，37℃孵育2 h，洗涤3次，按常规方法抽提HEV RNA，采用逆转录-套式聚合酶链反应法(RT-nPCR)检测HEV RNA，以PCR结果阴性判为中和试验阳性。

2 结 果

2.1 融合及筛选

获得3株稳定分泌抗R166 McAbs的杂交瘤细胞株，即1C1、6F9和10D2。以 R166 检测阳性，His-HCV NS3重组蛋白检测阴性，说明所制备的McAbs是针对R166中HEV基因编码蛋白的特异性抗体。

2.2 McAb的类和亚类的鉴定及效价测定

将3株杂交瘤细胞直立培养2周后收集上清，同时也制备腹水，经 ELISA鉴定，1C1、6F9和10D2类和亚类鉴定均为IgG1，6F9和10D2腹水的抗体滴度均为1∶10-5，1C1腹水的抗体滴度为 1∶10-4。

2.3 HEV重组蛋白抗原表位的分析

2.3.1 HEV 1-4基因型及兔HEV p166重组蛋白序列分析 比较已知HEV1-4基因型代表株缅甸株、墨西哥株、美国株和中国株及兔HEV JS120株编码p166蛋白的核苷酸序列，同源性为74.2%～80.9%，但在氨基酸水平，同源性高达88.0%～94.0%，提示不同基因型的p166重组蛋白在氨基酸水平具备相当的保守性，有可能存在共同的抗原表位。从氨基酸位点的差异来看(如图 1 所示)，与 p166Bur、p166Mex、p166Us和p166Chn相比，R166有5个氨基酸残基的改变，分别位于81、125、130、155和163位点，提示兔 HEV 有可能存在与已知基因型HEV不同的抗原表位。

2.3.2 ELISA分析 采用已知4个基因型HEV的p166 重组蛋白(p166Bur、p166Mex、p166Us和 p166Chn)和兔HEV的p166重组蛋白(R166)作为包被抗原进行ELISA检测。3株杂交瘤细胞株中，1C1和6F9与5种p166均反应;10D2只与R166反应，而不与p166Bur、p166Mex、p166Us和 p166Chn反应。提示 R166与已知4个基因型HEV重组蛋白p166含有共同的抗原表位，也存在R166特有的抗原表位。

2.3.3 Western blotting分析 根据本研究中p166重组蛋白的氨基酸残基数目，p166Bur、p166Mex、p166Us、p166Chn和R166等5种重组蛋白的分子质量约为24 kDa，其SDS-PAGE可见预期条带(图2)。将3株杂交瘤细胞分泌的McAbs分别进行western blot检测，1C1株和6F9株在5种重组蛋白泳道均出现特异性24 kDa棕色反应条带，10D2株仅在R166泳道出现特异性24 kDa棕色反应条带，在其他泳道均无特异条带出现(图3)。3株McAbs的Western blotting检测结果与上述ELISA检测结果完全一致，再次提示R166与已知1-4基因型HEV含有共同的和不同的抗原表位。

2.4 McAb中和活性的鉴定

基于PCR的HEV体外中和试验检测显示，3株McAbs均不能阻断基因1、4型人HEV及兔HEV对培养细胞的感染性，不具有中和活性，提示这3株McAbs结合的抗原表位是非中和性表位。

3 讨 论

由于缺乏成熟的HEV细胞培养模型，目前HEV诊断主要依靠基因工程表达的重组蛋白或合成肽作为HEV特异性抗体检测的包被抗原。HEV ORF2编码的结构蛋白由660个氨基酸组成，其C端的2/3部分含有多个具有免疫优势的B细胞表位，广泛应用于HEV感染的免疫诊断及疫苗研究。我们前期研究发现，HEV ORF2 C端基因编码的一段含有166个氨基酸残基的重组蛋白(aa452-617)，含有HEV构型依赖性中和抗原表位，用缅甸株p166Bur(1型)免疫血清能够交叉中和3种不同基因型的HEV毒株(1型巴基斯坦株、2型墨西哥株、3型美国株)，提示不同基因型p166含有共同的中和抗原表位［9］。而后我们在抗原表位的分析研究中，分别制备出来源于第1、2、3和4基因型重组蛋白p166Bur、p166Mex、p166Us和p166Chn的McAb，发现4种基因型存在共同的抗原表位和基因型特异性的抗原表位［10-13］。另外，有研究提示某些感染3、4型HEV的病人对1、2型重组抗原制备的免疫诊断试剂缺乏IgG或IgM反应性［14-15］;我们也发现不同基因型和亚型的HEV重组蛋白p166对不同血清标本HEV抗体检测的敏感性高低不同［16-17］。

图1 HEV 1(Bur)、2(Mex)、3(Us)、4(Chn)基因型及兔HEV代表株 ORF2 p166重组蛋白的氨基酸序列比较Fig 1 Amino acid comparison of ORF2 p166 combinant proteins encoded by genotype 1(Bur)，2(Mex)，3(Us)，4(Chn)and rabbit HEV

图2 5种不同基因型p166重组蛋白的SDS-PAGE图谱Fig 2 SDS-PAGE analysis of five different genotypes HEV p166 recombinant proteins

近年来，我国学者首先在兔体内分离出一种新的HEV［6］，可能构成HEV的新基因型。本实验室也在江苏家兔体内分离出兔HEV，其抗原表位特点有待阐明。我们选取一株兔HEV-JS120制备p166重组蛋白，免疫动物并制备McAbs，分析兔HEV与已知基因型HEV抗原表位的异同。本研究共得到3株能稳定分泌兔HEV p166相关的杂交瘤细胞株，ELISA及Western blotting检测结果提示，1C1株和6F9株是兔HEV与已知4种基因型HEV的共同型McAb，而10D2是兔HEV的特异性McAb，表明兔HEV与已知4种基因型HEV既含有共同的又含有不同的抗原表位。对5种p166氨基酸序列进行分析，R166有5个氨基酸残基的改变，分别位于81、125、130、155和163位点。10D2只与R166反应，而不与其他4种p166反应，提示上述5个位点中的一个或多个氨基酸残基的改变可能是引起R166抗原表位变异的原因，这种现象在已知HEV其他基因型和其他病毒中也有报道［10］。利用基于PCR的HEV体外中和试验，本研究所获得的3株McAbs均不能中和兔HEV及基因1、4型HEV，提示3株McAbs针对的抗原表位是非中和性抗原表位。

图3 McAb(1C1、6F9和10D2)与5种不同基因型p166重组蛋白的免疫印迹反应Fig 3 Wester blotting analysis of McAb(lc1，bFa and 10D2)reacted with five different genotypes HEV p166 recombinant proteins

综上所述，兔HEV作为一种新发现的HEV，其编码重组蛋白R166与已知1-4基因型HEV ORF2 p166含有共同的和不同的抗原表位，这些异同有助于深入研究不同基因型HEV抗原表位的变异，更加深入认识兔HEV的生物学特性，对扩展HEV的动物宿主的认识和防治具有重要价值。

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